一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用。本发明专利技术所提供的隶属于R型水合酶的基因片段编码的蛋白是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。实验证明，本发明专利技术所提供的MaoC-Del63-88蛋白对于底物巴豆酰辅酶A（Crotonyl-CoA）具乙酰辅酶A水合酶活性，其酶活达126.7U/mg，显著高于原始MaoC蛋白的酶活（58.1U/mg）。本发明专利技术所提供的MaoC-Del63-88蛋白及其编码基因可用于有效合成聚羟基脂肪酸酯（PHA），为进一步应用绿色塑料聚羟基脂肪酸酯（PHA）提供了一定的技术储备。

【技术实现步骤摘要】
—种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用
本专利技术属于生物
，涉及一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用，特别涉及一种隶属于R型水合酶的基因片段MaoC-Del63-88及其编码蛋白与应用。
技术介绍
在过去的50年内，石油化工塑料已是应用最多的材料，主要是因为这类塑料具有多种结构、多种性能，且原材料价格低廉。目前这类塑料产量年增长速度为9.9%，但给人类带来了严峻的“能源问题”和“环境问题”。生物降解塑料是近些年发展起来的被全球公认的一种真正绿色环保塑料，易于被环境中的有机物质降解，从根本上解决“白色污染”问题。目前全球研发的生物降解塑料品种已有几十种，其中聚羟基脂肪酸酯(PHA)是其中最为活跃的研究热点。PHA作为一种“生物可降解塑料”除用于环境友好型包装之外，还可用于热敏胶、压敏胶和水溶胶及拉成纤维等。此外，基于PHA具生物可降解和生物相容性，PHA可作为医用植入材料和可控药物缓释载体，PHA的寡聚物可作为酮体供体的营养添加剂，PHA的手性单体作为药物或手性合成的中间体，PHA膜蛋白可用于某些微量蛋白的分离；PHA合成基因还可用于调节微生物的新陈代谢，调节微生物于逆境条件下的生存能力，由此可用于改造工业微生物菌株，提高微生物发酵的效率等。PHA的生物合成是一个受多种酶参与催化、由不同的代谢途径控制的复杂过程。PHA合成需要β-酮基硫解酶、乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHA聚合酶等。此外，(R)-专一的烯酰辅酶A水合酶(PhaJ)能通过脂肪酸的β_氧化提供合成PHA的前体物，它的使用为脂肪酸在重组菌株中合成PHA提供了有力的工具。隶属于R型水合酶((R) -hyd`ratase )的一种新酶类单胺氧化酶C类水合酶(MaoC-like hydratase, MaoC)是最近发现的一种新乙酰辅酶A水合酶(Enoyl-CoAhydratase),该酶在脂肪酸β -氧化至PHA的合成过程中提供(R)-专一的轻烷基辅酶A(R-3-hydroxyacyl-CoA)。MaoC已经被证明对底物巴豆酰辅酶A (Crotonyl-CoA)具乙酰辅酶A水合酶(Enoyl-CoA hydratase)的活性。MaoC因具乙酰辅酶A水合酶(Enoyl-CoAhydratase)活性而成为与PHA合成相关的众多酶类成员之一。作为生态环境友好型塑料，PHA是最具环保和最具发展前景的绿色塑料之一，该类塑料的不断开发和应用领域的不断拓宽将会给人类生活带来极其深远的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种隶属于R型水合酶的基因片段及其编码蛋白与应用。本专利技术所提供的隶属于R型水合酶的基因片段的编码蛋白，名称为MaoC-Del63_88,是由类单胺氧化酶C类水合酶(MaoC-like hydratase, MaoC)蛋白(GenBank:⑶190361)进行部分氨基酸缺失后所得的蛋白，具体是如下(a)或(b ):(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，即删除了 MaoC蛋白(GenBank:⑶190361)的第63-88位氨基酸后所得的蛋白；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。序列表中序列2由272个氨基酸残基组成。为了便于MaoC-Del63-88蛋白的纯化，可在由序列表中序列2的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。表:标签的序列 标签残基序列 Poly-Arg5-6 (通常为 5 个) RRRRR Poly-His2-10 (通常为 6 个) HHHHHH FLAG8DYKDDDDK Strep-tag II8WSHPQFEK c-myc10EQKLISEEDL上述(a)中的MaoC-Del63_88蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的MaoC`-Del63-88蛋白可通过如下方法得到:将序列表中序列I所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上上表所示的标签的编码序列得到编码基因，再进行生物表达得到MaoC-Del63-88蛋白。编码所述MaoC-Del63_88蛋白的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本专利技术的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为MaoC-Del63-88);所述MaoC-Del63_88基因是如下I) _4)中任一所述的DNA分子:I)编码序列为序列表中序列I的DNA分子；2)序列表中序列I所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码所述MaoC-Del63_88蛋白的DNA分子；4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述MaoC-Del63_88蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65° C下杂交，然后用2XSSC，0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。其中，序列I由819个核苷酸组成，整个序列即为其编码序列，编码序列表中序列2所示的蛋白质。含有所述核酸分子(MaoC-Del63-88基因)的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本专利技术的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因(GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)等。在本专利技术中，所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为T7启动子。在本专利技术的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pET28a(+)载体的多克隆位点(如BamH I和EcoR I)处插入所述MaoC-Del63_88基因后所得的重组质粒。所述表达盒由能够启动所述MaoC-Del63_88基因表达的启动子，所述MaoC-Del63-88基因，以及转录终止序列组成。所述MaoC-Del63_88蛋白，或所述MaoC-Del63_88基因，或所述重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒在如下任一中应用也属于本专利技术的保护范围:(I)水解巴豆酰辅酶 A (Crotonyl-CoA)；(2)制备水解巴豆酰辅酶A (Crotonyl-CoA)的产品；·(3)作为乙酸辅酶 A 水合酶(Enoyl-CoA hydratase)；本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.蛋白质，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有水解巴豆酰辅酶A活性的由序列2衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于:所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是如下I)-4)中任一所述的DNA分子: 1)编码序列为序列表中序列I的DNA分子； 2)序列表中序列I所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子; 4)与I)或2)或3)限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞、重组菌或重组病毒。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。·6.根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于:所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子为T7启动子。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：张修国，王会征，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：