本发明专利技术公开了一种放射形土壤杆菌，其表达的奎宁酮还原酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇中的应用。与制备(R)-3-奎宁醇的其他方法相比，使用本发明专利技术的奎宁酮还原酶所制备的(R)-3-奎宁醇不仅产物浓度高，而且光学纯度好，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在抗胆碱药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种放射形土壤杆菌，其表达的奎宁酮还原酶及其基因，含有该基因的重组表达质粒和重组表达转化体，其重组酶及其制备方法，以及该重组酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇中的应用。与制备(R)-3-奎宁醇的其他方法相比，使用本专利技术的奎宁酮还原酶所制备的(R)-3-奎宁醇不仅产物浓度高，而且光学纯度好，反应条件温和，操作简便，易于放大，因此在抗胆碱药物中间体的生产中具有很好的工业应用前景。【专利说明】一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用
本专利技术属于生物工程
,具体涉及一种放射形土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter) CGMCC7986，该放射形土壤杆菌表达的奎宁酮还原酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，及其重组酶和该重组酶的制备方法，还涉及该奎宁酮还原酶或其重组酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮以制备(R)-3-奎宁醇中的应用。
技术介绍
(R)-3-奎宁醇(分子式为 C7H13NO,分子量为 127.18，CAS 号=25333-42-0)是合成多种抗胆碱药物(如他沙利定、瑞伐托酯等)的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗慢性阻塞性肺病、老年痴呆症等。(R)_3-奎宁醇的手性合成技术具有广阔的应用前景。(R)-3-奎宁醇的合成有化学法和生物法两种。与化学方法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、立体选择性强等多种优点。生物法又包括动力学拆分和不对称合成。生物不对称合成法研究得较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。日本Sakayu Shimizu课题组利用从深红酵母(Rhodotorula rubra)中克隆得到的还原酶催化3-奎宁酮不对称还原得到(R)-3-奎宁醇，产物浓度达到618mM，且对映体过量值(ee)>99.9%，但此酶的&值高达145mM，这一高Km值表明该酶对底物的亲和力较弱，底物浓度较低时反应速率较慢，底物浓度为120mM时，反应速率仅为最大速率的46%，导致反应时间的延长(Appl.Microbiol.Biotechnol.2009, 83, 617-626)。朱敦明等利用传统的土壤筛选法分离到两株微生物:诺卡氏菌(Nocardia sp.)WY1202和红串红球菌(Rhodococcuserythropolis) WY1406，催化3-奎宁酮的不对称还原分别生成(R)-奎宁醇和(S)-奎宁醇，底物最高浓度为 99mM(J.Mol.Catal.B-Enzym.2013, 88, 14-19)。日本 Nobuya Itoh 等人筛选到一株淡黄微杆菌(Microbacterium luteolum) JCM9174,该菌能够还原3-奎宁酮生成(R)-奎宁醇，并从中挖掘到两个NADH依赖性还原酶QNR和BacC，它们能催化313mM底物的转化，12小时转化率分别达到100%和94%，且ee>99.9%。QNR和BacC经纯化后，测得其比活力分别为 8.4U/mg 和 0.5U/mg (Appl.Environ.Microbiol.2013, 79, 1378-84)。然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，以及反应时间较长等缺陷，不适合工业化生产(R)_3-奎宁醇(一般要求产物浓度应在100g/L以上)。因此，仍然需要筛选活力高、且能以较短反应时间获得较高产物浓度的奎宁酮还原酶，以满足工业化生产(R)-3-奎宁醇的需求。
技术实现思路
针对生物催化不对称合成(R)-3_奎宁醇中现有酶的上述缺陷，专利技术人提供了一种放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter) CGMCC7986,该菌株所表达奎宁酮还原酶的催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好。另一方面，专利技术人提供了一种新的奎宁酮还原酶，所述奎宁酮还原酶的编码基因，含有所述基因的重组表达载体、重组表达转化体，以及所述奎宁酮还原酶的高效制备方法。另一方面，专利技术人还提供了利用所述放射形土壤杆菌、所述奎宁酮还原酶来催化不对称合成(R)-3-奎宁醇的方法。在一种实施方式中，本专利技术涉及放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC7986，该菌所表达的奎宁酮还原酶能高效催化奎宁酮不对称还原以制备(R) _3_奎宁醇。例如，在底物浓度为IOmM时，以所述放射形土壤杆菌的Ig湿细胞为生物催化剂能在12小时内使奎宁酮的转化率达93%，产物的光学纯度为99%ee(R)。在另一种实施方式中，本专利技术涉及奎宁酮还原酶,所述酶是:(a)由序列表中SEQID N0.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；或(b)由SEQ ID N0.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有奎宁酮还原酶活性的衍生蛋白质。在一个具体的实施方式中，所述衍生蛋白质具有SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列。本专利技术还涉及蛋白质的编码基因，其编码的蛋白质可用于以奎宁酮为底物不对称还原制备(R)-3-奎宁醇。在一个具体的实施方式中，本专利技术提供编码上述蛋白质(a)或(b)的基因。在一个更具体的实施方式中，所述基因为奎宁酮还原酶基因，其具有SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列。本专利技术的奎宁酮还原酶基因可以克隆自放射形土壤杆菌CGMCC7986或者按照本领域常规技术合成得到。本专利技术提供一种包含本专利技术还原酶基因的核苷酸序列的重组表达质粒。其可通过本领域常规方法将本专利技术的还原酶基因的核苷酸序列连接于各种合适载体上构建而成。所述载体可以是本领域的各种常规载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选质粒，更优选质粒pE T28a。所述还原酶基因可以操作性连接于表达合适的调控序列，以实现所述奎宁酮还原酶的组成型或诱导型表达。本专利技术提供一种包含本专利技术还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主细胞中来制得所述重组表达转化体。所述宿主细胞可以是本领域的各种常规宿主细胞，前提是能使所述重组表达载体稳定地自行复制，且其所携带的还原酶基因可被有效表达。本专利技术优选大肠杆菌，更优选大肠埃希氏菌(E.coli)BL21 (DE3)或大肠埃希氏菌(E.coli)DH5 α。本专利技术还提供一种重组奎宁酮还原酶的制备方法，其包括如下步骤:培养本专利技术的重组表达转化体，获得重组奎宁酮还原酶。其中，培养所述重组表达转化体所用的培养基可选自本领域的常规培养基，前提是可使转化体生长并产生本专利技术的还原酶。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行。本专利技术提供一种新型的奎宁酮还原酶作为催化剂，应用于3-奎宁酮的不对称还原以制备(R)_3-奎宁醇。所述不对称还原反应的底物为3-奎宁酮，具体的反应条件如底物浓度、pH、缓冲液组成、酶用量等可按本领域此类反应的常规条件进行选择。所述的不对称还原反应可在振荡或搅拌条件下进行。所述不对称还原反应的时间优选以转化率>99%为准。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法，从反应混和液中提取手性醇产物。本专利技术的积极进步效果在于:本专利技术提供了一种放射形土壤杆菌菌株，以及由该菌株表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种放射形土壤杆菌(Agrobacterium?radiobacter)CGMCC7986，其特征在于，所述放射形土壤杆菌表达奎宁酮还原酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：许建和，郁惠蕾，张文霞，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：
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