本发明专利技术提供芦笋查尔酮合成酶基因及其编码的蛋白与应用。芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术首次从芦笋中克隆得到查尔酮合成酶基因AoCHS1，该基因为植物类黄酮合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将基因AoCHS1转化到目标植株中，可促进转基因植株中总黄酮含量的增加，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程
，具体地说，涉及芦笋查尔酮合成酶基因及其编码的蛋白与应用。
技术介绍
植物活性次生代谢产物是其代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛深入，独具特色又有广阔应用前景的植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点。类黄酮是植物中重要的次生代谢产物之一，具有重要的抗氧化和清除自由基的功能，对于提高人体免疫力具有重要作用。研究发现，在植物类黄酮生物合成途径中，查尔酮合成酶是第一个关键酶，又称限速酶，它催化丙二酰CoA的3个乙酸基和β-香豆酰CoA的1个乙酸基发生缩合反应，产生查尔酮，形成类黄酮物质的基本碳架结构，查尔酮合成酶是植物次生代谢途径中的关键酶之一，对植物具有非常重要的生理意义。芦笋(Asparagus officinalis L.)为天门冬科天门冬属多年生草本植物，以嫩茎供食，具有极高的营养和保健价值，富含黄酮、皂苷、天冬酰胺、硒和植物多糖等多种活性成分，能抗肿瘤、抗氧化和降血脂，被誉为“蔬菜之王”、“世界十大名菜”之一(Jaiswal et al.，2014；Nishimura et al.，2013)。同时，芦笋加工产业链长，可生产出芦笋抗癌药、芦笋茶、酒和饮料等高附加值产品，在食品、医药等领域应用开发前景广阔。目前，我国芦笋种植及加工发展迅速，已成为世界第一大生产和出口国，种植面积超过95，000公顷，约占全球的43％(陈光宇，2013；张岳平等，2013)。目前，已从很多植物中克隆得到查尔酮合成酶基因(CHS)，如拟南芥、水稻、矮牵牛、葡萄、大豆等。然而，芦笋作为富含黄酮的 重要保健蔬菜作物之一，目前未有任何与芦笋CHS基因及其编码蛋白的相关文献报道，对于芦笋CHS基因及其编码的蛋白序列尚不清楚。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供芦笋查尔酮合成酶基因及其编码的蛋白。本专利技术的另一目的是提供芦笋查尔酮合成酶基因在调控植物类黄酮生物合成中的应用。本专利技术针对芦笋中类黄酮活性物质生物合成途径基础研究薄弱的现状，首次克隆得到芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1，并进一步分析了该基因在促进类黄酮生物合成中的作用。本专利技术通过对芦笋的全基因组高通量测序结果进行分析，设计一对特异引物(SEQ ID NO:3-4)，对芦笋品种‘井冈111’嫩茎样品cDNA进行PCR扩增，获得了芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1的CDS序列(全长1191bp)，基因AoCHS1的CDS序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。本专利技术还提供芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本专利技术还提供含有芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1的表达盒、载体、工程菌及转基因细胞系。携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒 载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2nd Edition)，并将转化的植物组织培育成植株。使用本专利技术的基因片段构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸的前端可添加任意一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或者植株进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记物(例如卡那霉素或潮霉素等)。被转化的宿主是包括烟草在内的多种植物，培育不同黄酮含量的植物种类。本专利技术还提供芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1在调控植物类黄酮生物合成中的应用。本专利技术还提供芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1在提高转基因植物总黄酮含量中的应用。在本专利技术的一个具体实施方式中，将基因AoCHS1构建到载体pCAMBIA2301上，用所得重组载体转化烟草，筛选阳性转基因植株。优选地，采用农杆菌介导的遗传转化法转化烟草，转化所用农杆菌为EHA105。本专利技术进一步提供利用上述基因工程技术获得的改良植物(总黄酮含量增加)在食品、保健品和生物医药领域中的应用。本专利技术首次从芦笋中克隆得到查尔酮合成酶基因AoCHS1，该基因为植物类黄酮合成路径中的关键基因之一，采用基因工程的方法，将基因AoCHS1转化到目标植株中，可促进转基因植株中总黄酮含量的增加，为今后利用基因工程技术改良植物品质，获得具有高抗氧化性的药物或食物提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值，附图说明图1为本专利技术实施例3中AoCHS1基因在转基因烟草中表达量的检测结果；其中图1A是烟草内参基因Actin的跑胶图，1-7为7个转基因株系，WT为对照野生型烟草，M为分子量大小；图1B是转AoCHS基因的跑胶图，1-7为7个转基因株系，H2O为阴性对照，WT为对照野生型烟草，P为重组质粒pCAMBIA2301-AoCHS1，M为分子量大小。图2为本专利技术实施例4中总黄酮标准曲线图。图3为本专利技术实施例4中对照野生型烟草与转化AoCHS1基因的烟草植株总黄酮含量图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1 AoCHS1基因的克隆 通过前期对芦笋新品种‘井冈111’(JK111)的全基因组高通量测序结果进行分析，设计特异引物P1正向引物:5’-ATGGCTGCAACATCAATG-3’和P2反向引物:5’-CTATATAGGCACACTGTGAAG-3’(SEQ ID NO:3-4)，采用常用的CTAB法(参照《植物基因工程》，王关林，方宏筠主编)从芦笋品种‘井冈111’中提取嫩茎总RNA，并反转录合成cDNA，利用上述引物P1和P2从RNA反转录得到的cDNA中扩增出如SEQ ID NO:1所示的芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1的CDS序列，基因AoCHS1的CDS序列全长1191bp。具体步骤如下：(1)向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液[2％(W/V)CTAB，NaCl 1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L， Tris·HCl 100mmol/L，2％(W/V)PVP]和10％β-巯基乙醇，在水浴锅中预热；(2)本文档来自技高网...
【技术保护点】
芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1，其特征在于，基因AoCHS1的CDS序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1，其特征在于，基因AoCHS1的CDS序列为：i)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或ii)SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；或iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。2.芦笋查尔酮合成酶基因AoCHS1编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或该序列经替换、缺失或添加一...
【专利技术属性】
技术研发人员：张岳平，陈光宇，瞿华香，罗绍春，汤泳萍，赵萍，周劲松，谢启鑫，
申请(专利权)人：江西省农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：江西;36
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