本发明专利技术公开了检测耳聋基因的核酸序列及其应用，属于基因测序和生物检验领域。一组检测耳聋基因的特异性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。本发明专利技术的优点是：本发明专利技术设计了一套全新的同时检测4个耳聋基因的全外显子共计9497bp的特异性多重PCR引物及使用该引物进行检测的方法。与现有技术相比，上述技术方案应用高通量测序技术进行耳聋基因检测，可以快速准确的检测所有位于4个耳聋基因上的突变位点，包括一直热点突变和新发突变。具有高通量、低成本、检出率高等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测耳聋基因的核酸序列及其应用，属于基因测序和生物检验领域。具体为检测4个耳聋基因的全外显子的检测方法，以及所述方法中使用的特异性引物，特别是涉及以多重PCR技术结合高通量测序技术进行检测的方法。
技术介绍
耳聋是一种最常见的感觉系统疾病，在新生儿中的发病率约为1/1000，其中约60％的耳聋患者是由于遗传因素造成的。按表型特点不同分为综合征性耳聋(SHI)和非综合征性耳聋(NSHI)。根据遗传方式不同将遗传性耳聋分为常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传、Y连锁遗传及线粒体遗传五类，其中以常染色体隐性遗传性耳聋最多见，约占75％-80％。大规模耳聋分子流行病学研究表明，我国人群中最常见的致病基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、线粒体DNA(12S rRNA)。GJB2基因定位在13q12区域，与DFNB1的表型相关，以轻度至极重度的语前感音神经性听力损失为多见，亦可表现进行性听力损害。GJB2基因全长4804bp，编码区678bp，含2个外显子，编码缝隙连接蛋白connexin26(Cx26)。如果缝隙连接复合物中的Cx26蛋白缺乏，就会妨碍去极化相进入细胞的钾离子在复极相回流，使Corti器局部钾离子中毒并造成耳聋。对GJB2基因型与表型的相关性研究，比较一致的认识是GJB2基因的缺乏造成先天性听力损失，而缺失、框移、剪接和不稳定转录等涉及功能缺失的突变可能与综合征或成年后耳聋有关，并且决定于突变位点的重要性及替换氨基酸的性质。GJB2基因突变范围几乎涉及该基因所有编码区域，突变形式包括剪切、无义突变、错义突变、插入及缺失导致移码突变等。GJB3定位于人类染色体1p33-35，编码有270个氨基酸的连接蛋白31，全长3617bP。GJB3基因编码的蛋白Cx31是间隙连接蛋白家族中的重要成员，分布在身体多个组织器官上，但以皮肤和内耳最多，其突变可导致可变性红斑皮肤角化病(EKV)、听力损伤和周围神经病变，是后天高频感音神经性耳聲患者的常见突变基因。SLC26A4基因又称PDS基因，位于人类染色体7q31，含有21个外显子，编码含有780个氨基酸的蛋白质Pendrin。SLC26A4基因与DFNB4表型相关，呈进行性或波动性症状，一般可以发展至极重度听力损失，累及所有频率。线粒体DNA突变易导致药物性耳聋，药物中毒性耳聋指的是使用某些药物治病或人体接触某些化学制剂所引起的耳聋。对耳功能有毒性作用，引起耳聋的药物，统称为耳毒性药物。多年来，由于大量化学药物和抗生素的广泛应用，己发现近百种耳毒性药物。mtDNA突变A1555G和C1494T，使得人体线粒体中的12S rRNA的结构与细菌的16S rRNA的结构更为相似，使得氨基糖苷类抗生素在与细菌结合的同时，与人体12S rRNA也形成了较为紧密的结合。已知AmAn发挥抗菌作用是靠其特异地与细菌核糖体结合，抑制蛋白合成或导致mRNA错译。A1555G突变产生的G-C碱基对有利于与AmAn结合。其结果破坏了线粒体蛋白的合成及减少了ATP的产量，使细胞内外离子浓度失衡，导致了耳蜗毛细胞的死亡。目前临床上对遗传性耳聋致病基因诊断的主要方法包括限制性长度多态性分析(RFLP)、斑点杂交(ASO)、基因扫描、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、直接测序、基因芯片方法等。但这些技术或耗时费力，或成本较高，或难以同时检测多个基因的不同突变位点，或只能用于检测已知突变对于新发突变或者低频突变无法覆盖。使用上述方法进行检测的主要用于检测GJB2基因位点：35delG、235del C、299del AT、176del16；GJB3基因位点：538C＞T；SLC26A4基因位点：2168A＞G、IVS7-2A＞G；以及12S rRNA位点：1494C＞T、1555A＞G。以上位点检测面窄，如GJB2基因的突变涉及所有外显子区域，因此需要一种覆盖度全的检测方法，涉及4个基因的全外显子区域。
技术实现思路
本专利技术要解决的第一个技术问题是提供一组同时检测GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子的耳聋基因检测引物。本专利技术要解决的第二个技术问题是提供一种同时检测GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子的耳聋检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一组检测耳聋基因的特异性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。参见表1所示。本专利技术根据选择目的基因GJB2/GJB3/SLC26A4/12S rRNA的外显子的DNA序列设计特异性引物。引物与引物之间不形成二聚体，引物自身不形成发夹结构，引物与模板之间不发生错配，且引物设计区域不存在突变位点。同时，在引物设计时，每对引物之间的退火温度差异小于2摄氏度，扩增产物长度在100-250bp之间。所述耳聋基因检测引物，能够同时检测GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外显子。表1耳聋基因扩增引物本专利技术采用多重PCR反应。根据引物设计方案，将表1中引物序列分组为8个引物池(引物pool)，参见表2所示，每个引物池中的引物为10-16对。表2耳聋基因扩增引物池(引物pool)其中引物池ID NO：1至引物池ID NO：4使用rTaq酶进行扩增；引物池ID NO：5至引物池ID NO：8使用LA Taq酶进行扩增。为了区别不同样本，所有引物均在5’端带有样本标签序列，不同样本使用不同的标签序列。样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列，优选8个碱基，如表3中的16个标签序列。所述标签只是为了区别每个样品，以便用于同时检测多个样品，本领域技术人员可以根据需要以及通常的引物设计原则选择使用不同的标签，而实现本专利技术的目的。因此，在一些实施方案中可以使用任何可以达到上述目的，且不会与检测目的物相互作用的标签序列。表3样本标签序列表序号标签序列名称标签序列1PI-1CTGCGACT2PI-2TGTAGATA3PI-3TGATATCT4PI-4CGATGCTA5PI-5AGACTAGA6PI-6TGTCTGTG7PI-7CATACTGA8PI-8TGCTCGCA9PI-9ATGAGTAG10PI-10CTCACTAT11PI-11GTACTACT12PI-12TAGACTAG13PI-13TATGCTAC14PI-14ACTCGCTG15PI-15ATCACGCA16PI-16GCATGTGA一种检测耳聋基因的试剂盒，包含序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的引物序列。所述引物序列的5’端带有一个样本标签序列所述样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列，优选表3中的一个或多个核苷酸序列。所述检测耳聋基因的试剂盒，还包括rTaq酶(5U/ul)、10×PCR反应缓冲液、d NTP混合液(2.5mM)、LA Taq酶、2×GC反应缓冲液和灭菌蒸馏水。本专利技术还提供了一种检测耳聋基因的方法，使用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列同时检测样本的GJB2基因、GJB3基因、12S 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组检测耳聋基因的特异性引物，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一组检测耳聋基因的特异性引物，其特征在于：具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。2.一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：包含序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的引物序列。3.根据权利要求2所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述引物序列的5’端带有一个样本标签序列。4.根据权利要求3所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述样本标签序列为6～12个碱基的核苷酸序列。5.根据权利要求3或4所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于所述样本标签序列选自下述核苷酸序列中的一个或多个：(1)CTGCGACT；(2)TGTAGATA；(3)TGATATCT；(4)CGATGCTA；(5)AGACTAGA；(6)TGTCTGTG；(7)CATACTGA；(8)TGCTCGCA；(9)ATGAGTAG；(10)CTCACTAT；(11)GTACTACT；(12)TAGACTAG；(13)TATGCTAC；(14)ACTCGCTG；(15)ATCACGCA；(16)GCATGTGA。6.根据权利要求5至7中任一项所述的一种检测耳聋基因的试剂盒，其特征在于：所述检测耳聋基因的试剂盒，还包括rTaq酶(5U/ul)、10×PCR反应缓冲液、d NTP混合液(2.5mM)、LA Taq酶、2×GC反应缓冲液和灭菌蒸馏水。7.一种检测耳聋基因的方法，其特征在于：使用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列同时检...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨光辉，岑忠，崔书建，
申请(专利权)人：上海凡迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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