大麦木糖异构酶基因的功能及其应用制造技术

本发明专利技术发现了来自大麦的基因具有木糖异构酶功能，可转化木糖为木酮糖。本发明专利技术构建了包含该基因的重组质粒，并将该质粒导入酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，将木糖异构酶基因在宿主细胞及表达后，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母获得了该转化能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及大麦木糖异构酶基因转化木糖为木酮糖的功能，本专利技术还涉及含该基因的重组质粒及工程菌株，以及用该工程菌通过发酵含有木糖的培养基制备こ醇和其他发酵产物的应用。
技术介绍
植物的木质纤维素中可发酵糖主要为葡萄糖和木糖，后者占木质纤维素的25%。但是，大部分能够发酵葡萄糖以制备こ醇的酵母(如酿酒酵母)不能够以木糖作为碳源。如果能够将植物的木质纤维素中的木糖异构化，生成木酮糖，木糖就可以作为碳源进行こ醇发酵。而若能找到高效的木糖异构酶(D-xylose isomerase, XI),催化五碳糖D-木糖转化 为D-木酮糖，便可达到此目的。现有技术的木糖异构酶基因多来自于微生物。如Escherichia coli, Bacillussubtilis,Thormotoga species,Thermus species等等。但迄今为止只有少数几种且多为嗜热细菌的木糖异构酶基因在こ醇生产传统菌株酿酒酵母中得到活性表达，而且在30°C左右的こ醇发酵温度下普遍由于活性太低而成为木糖代谢途径的限速步骤。因此，发现新的可在酿酒酵母里高效表达的木糖异构酶，提供能够转化木糖生成木酮糖的酵母工程菌，井能克服现有技术的限制，即在30°C左右的こ醇发酵温度下具有足够的酶活，很有必要。
技术实现思路
本专利技术的目的是从大麦中筛选出新的木糖异构酶基因，并将该基因导入酿酒酵母，使所得到的酵母遗传工程菌获得将木糖转化为木酮糖的能力。本专利技术人通过分析数据库大麦基因组序列的方式，首次从大麦基因组序列中发现了具有木糖异构化功能的基因(GenBank NO. X95257)，并将其命名为“大麦木糖异构酶基因”。并通过实验发现，该基因编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。现有技术的文献仅在转录水平上证实了基因(GenBank NO. X95257)的存在，但未公开过其所具有的任何功能，以及可利用该基因做何种用途的研发。本专利技术构建了具有大麦木糖异构酶基因的重组质粒，并将该质粒导入了酿酒酵母中，获得了一种新的酵母工程菌。经实验证实，原来不具备转化木糖为木酮糖的能力的酿酒酵母赋予了该转化能力。本专利技术进行了如下具体工作I.提取大麦mRNA，反转录生成cDNA，用保守引物克隆得大麦木糖异构酶基因，其大小为1443bp。2.将大麦木糖异构酶基因片段连接到PYES2质粒载体中，构建具有完整木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI。3.将含大麦木糖异构酶基因的重组质粒pYES-WXI通过电击转化方法导入不具将木糖转化为木酮糖的能力的酿酒酵母中，获得能够将木糖转化为木酮糖的遗传工程酵母菌株W(详见实施例5)。因此本专利技术的木糖异构酶基因有益效果是大麦木糖异构酶基因赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。且大麦木糖异构酶基因工程菌株的木糖利用率可达51. 78 %，大大高于对照菌株(详见实施例6)。具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株只是用于对本专利技术作进ー步详细说明，并不对本专利技术的实质内容加以限制。实际上，用本专利技术发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有将木糖转化为木酮糖能力的遗传工程菌株，均不能脱离本专利技术的精神和思路。以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均參照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克ー书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。试验材料和试剂I、菌株及载体酿酒酵母表达载体pYES2购自Invitrogen公司，酿酒酵母菌株CEN.PK113- (表型为MatA ura3_52)及大肠杆菌DH5 a由所在实验室保存。2、酶类及其它生化试剂内切酶及连接酶购自NEB公司，其它试剂如未作具体说明都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。3、培养基(I)大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1% NaCl，pH7.0)；(2)酵母培养基YPD(1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂);(3)选择培养基SC(0. 67% YNB、2%葡萄糖，平板添加2%琼脂)。实施例I获取大麦cDNA(一 )植物总 RNA 提取-Trizol 法I、将组织在液氮中磨成粉末后，取50_100mg组织，加入ImlTrizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。2、研磨液室温放置5min,然后加入0. 2ml氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15s03、取上层水相于一新的离心管，加入0. 5ml异丙醇，室温放置lOmin，12000g离心IOmin04、弃去上清液,加入1111175%こ醇，润旋混勻，4°C下7500g离心5min。5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10min，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55°C _60°C水溶IOmin。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70 %こ醇并保存于_70°C。(ニ)mRNA 提取由于mRNA末端含有多poly⑷+,当总RNA流经oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在OI igo (dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo (dT)纤维素柱，可得到较纯的mRNA。I、用 0. IMNaOH 悬浮 0. 5-1. Og oligo (dT)纤维素。2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0. 5-1. 0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用IX柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8. O。 4、将(一)中提取的RNA液于65°C温育5min后迅速冷却至室温，加入等体积2 X柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后，加入I倍柱床体积的IX层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD26tl,当洗出液中OD26tl为0时，加入2_3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。6、测定OD26tl,合并含有RNA的洗脱组分。7、加入1/10体积的3MNaAc (pH5. 2)，2. 5倍体积的冰冷こ醇，混匀，_20°C 30min。8、4°C下12000g离心15min,小心弃去上清液,用70%こ醇洗漆沉淀,4°C下12000g离心5min。9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥IOmin,或真空干燥lOmin。10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成(或保存在70 %こ醇中并贮存于-70 0C )。(三)反转录生成cDNAI、在冰浴的试管中加入如下反应混合物模板RNA 1-5 U g 总 RNA (DNase 处理后)引物oligo(dT)无RNA 酶去离子水(RNase-free ddH20):定容至 12 U I。2、轻轻混匀后离心3_5s。反应混合物在70°C水浴5min后，冰浴30s，然后离心3 5s03、将试管冰浴，再加入如下组分5 X Reaction Buffer 4 U IRNasin (20U/U I) 1 U IdNTP mix(IOmM) 2u I4、轻轻混匀后离心3-5s。37°C水浴5min，加入I iilMMLV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大麦木糖异构酶基因(GenBankNO. X95257)的用途，其编码的木糖异构酶在宿主细胞中表达后，赋予宿主细胞将木糖转化为木酮糖的能力。2.权利要求I所述的用途，所述宿主细胞是酿酒酵母。3.含大麦木糖异构酶基因的重组质粒，是大麦木糖异构酶基因(GenBankNO. X95257)连接到在酿酒酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：顿宝庆，王智，李桂英，路明，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：