【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及昆虫防治领域及真菌基因工程技术，具体涉及敲除球孢白僵菌bbcdr1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用，还涉及制备球孢白僵菌改良菌株的方法。
技术介绍
1、球孢白僵菌是一种广谱的昆虫病原真菌，凭借其优越的繁殖潜能和宽广的宿主范围以及绿色、环保、易于施用等诸多优势，被广泛地应用于农林害虫的生物防治。我国使用球孢白僵菌防治马尾松毛虫和玉米螟是国际上最大的害虫防治项目，取得了良好的害虫持续控制效果。但是，现有的球孢白僵菌菌株具有致病速度慢、致死率低、环境适应力差等问题，严重限制了球孢白僵菌的规模化应用。
2、分生孢子是球孢白僵菌侵染宿主时的繁殖体，也是抵抗逆境进行生存和繁殖重要结构。球孢白僵菌在侵染宿主时，其无性繁殖产生的分生孢子，经风和动物等媒介的传播后散落在昆虫的角质层上，通过萌发形成附着胞。附着胞分泌水解酶降解昆虫体壁的角质层，并在机械压力的作用下穿透宿主的角质层，侵入宿主的血腔(ortiz-urquiza andkeyhani,2013)。侵入宿主血腔之后，球孢白僵菌会变化为精密的虫菌体结构，逃避宿主免疫系统的识别的同时通过吸取宿主的营养物质进行增殖。宿主死亡之后，菌丝体重新变成分离菌丝，开始由内向外再次穿透体壁的角质层，并在宿主尸体上产生分生孢子，分生孢子在新的感染周期中继续传播(valero-jiménez et al.,2016；fan et al.,2017；lewis etal.,2009；cai q et al.,2018)。由此可见，球孢白僵菌的侵染过程以分生孢子附着宿主体壁开始，以在宿
3、转录因子调节的变化是真菌发育变化的重要原因，球孢白僵菌中既存在由3个转录因子brla-abaa-weta依次表达所构成的一个保守的中心发育途径(cdp)途径，也存在独特的转录因子来调控产孢和孢子发育过程。zn(ii)2cys6转录因子是真核生物特异性结合的转录因子中最大的家族之一的锌指蛋白家族的主要成员之一。bbcdr1为c6转录因子，因其包含一个只存在于真菌界的zn(ii)2cys6双核簇结构域，所以也被认定是真菌特有转录因子，在真菌菌体生长发育、产孢及胁迫应答等方面发挥着重要作用(chen et al.,2022)。通过真菌基因工程的技术改变转录因子的表达，影响球孢白僵菌分生孢子的产孢和发育过程，进而改变球孢白僵菌的杀虫和抗逆能力，是可行且十分有效的。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种敲除球孢白僵菌bbcdr1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用；本专利技术的目的之二在于提供一种制备球孢白僵菌改良菌株的方法。
2、为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、1、敲除球孢白僵菌bbcdr1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用，所述改良菌株为增强球孢白僵菌产孢能力、杀虫能力或抗逆能力。
4、本专利技术优选的，所述杀虫能力为杀大蜡螟能力。
5、本专利技术优选的，所述抗逆能力增加对非生物胁迫的抗性。
6、本专利技术优选的，所述非生物胁迫为刚果红、甲萘醌、山梨醇或高温。
7、本专利技术优选的，所述敲除球孢白僵菌bbcdr1基因的方法是：
8、(1)以球孢白僵菌的基因组为模板，分别利用seq id no.1与seq id no.2，seq idno.3与seq id no.4所示的序列为引物进行pcr扩增，扩增分别获得bbcdr1基因的左臂bbcdr1lb和右臂bbcdr1rb；
9、2)左臂通过同源重组的方法与经过ecorι线性化的载体pk2-sur-pb3-ops3进行连接，然后在已连接左臂的载体上使用xba i线性化，把右臂通过该位点连接到载体上，形成重组载体pk2-bbcdr1lb-sur-bbcdr1rb-pb3-ops3。
10、3)将重组载体pk2-bbcdr1lb-sur-bbcdr1rb-pb3-ops3通过农杆菌介导的方法转入球孢白僵菌野生型菌株，用载体上的sur基因来替换bbcdr1上800bp左右的片段，筛选突变体获得δbbcdr1菌株，为敲除球孢白僵菌bbcdr1基因的菌株。
11、分别将bbcdr1基因开放阅读框上游和下游的片段，分别为bbcdr1基因的左臂bbcdr1lb和右臂bbcdr1rb。
12、2、一种制备球孢白僵菌改良菌株的方法，其特征在于：将球孢白僵菌中bbcdr1基因敲除，获得产孢能力、杀虫能力或抗逆能力增加的球孢白僵菌。
13、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供了敲除球孢白僵菌bbcdr1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用，在球孢白僵菌中敲除转录因子基因bbcdr1，能提高球孢白僵菌的产孢量和侵染毒力并增强其抵抗热、无机胁迫能力。具体利用所述的使用重组载体敲除转录因子基因bbcdr1的球孢白僵菌分生孢子悬浮液接种在czm、pda和1/4sdya培养基上，统计5d、10d和15d单位面积培养基上的产孢量，发现在营养成分不同的培养基上，重组菌株的产孢量均显著高于野生型菌株(p<0.05)；使用重组载体敲除转录因子基因bbcdr1的球孢白僵菌分生孢子悬浮液通过体壁浸泡的方法侵染害虫大蜡螟，重组菌株侵染过的试虫的死亡率高于野生型菌株处理的试虫。说明通过在球孢白僵菌中敲除转录因子基因bbcdr1可以提增强孢白僵菌的杀虫能力；另外，将重组菌株和野生型的分生孢子悬液接种到czm培养基及添加了刚果红(cr)、甲萘醌(mnd)、山梨醇(sor)的czm培养基上，于26℃培养7天统计菌落直径，高温胁迫则为未添加胁迫的czm培养基在32℃下培养7天统计菌落直径，参照未经胁迫处理的培养基上的菌株并对比重组菌株和野生型菌株在胁迫下的相对抑制率。重组菌株对以上4种胁迫的抗性极显著强于野生型菌株(p<0.01)。说明通过在球孢白僵菌中敲除转录因子基因bbcdr1可以增强产孢、杀虫能力并显著提高其抗热胁迫能力。杀虫能力是球孢白僵菌作为生防真菌的主要功能，产孢能力又是球孢白僵菌杀虫的决定因素，增强产孢和杀虫能力对于提升球孢白僵菌的实际应用具有根本性的意义，同样，增强分生孢子抵抗环境中无机及热等胁迫的能力也是球孢白僵菌实际应用价值的重要因素。因此，本专利技术获取敲除转录因子bbcdr1的球孢白僵菌具有广泛的实际应用价值。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.敲除球孢白僵菌BbCDR1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用，其特征在于：所述改良菌株为增强球孢白僵菌产孢能力、杀虫能力或抗逆能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述杀虫能力为杀大蜡螟能力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗逆能力增加对非生物胁迫的抗性。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非生物胁迫为刚果红、甲萘醌、山梨醇或高温。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述敲除球孢白僵菌BbCDR1基因的方法是：
6.一种制备球孢白僵菌改良菌株的方法，其特征在于：将球孢白僵菌中BbCDR1基因敲除，获得产孢能力、杀虫能力或抗逆能力增加的球孢白僵菌。
【技术特征摘要】
1.敲除球孢白僵菌bbcdr1基因在制备球孢白僵菌改良菌株中的应用，其特征在于：所述改良菌株为增强球孢白僵菌产孢能力、杀虫能力或抗逆能力。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述杀虫能力为杀大蜡螟能力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述抗逆能力增加对非生物胁迫的抗性。
4.根...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。