本发明专利技术公开了一种采用芥菜型油菜基因BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明专利技术从芥菜型油菜紫叶芥种皮的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因和4-二氢黄酮醇还原酶DFR基因，构建含BAN和DFR基因的原核表达载体pET-BAN-DFR，将BAN和DFR基因同时导入DH5α大肠杆菌。转化菌株在LB液体培养基中，25-37℃，150-250rpm(转/分钟)培养6-14小时候后，再在含黑色大豆种皮提取物(0.5-1.0g/L)的LB液体培养基中，25-37℃，150-250rpm震荡培养36-54小时后，离心收集菌体，采用DMACA-HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量。本发明专利技术获得的转基因大肠杆菌中原花色素的含量显著提高，最高达到非转化对照菌株的19.8倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种基因工程和微生物发酵
的方法，特别是一种采用双关键酶基因共转化和在培养基中添加关键酶基因催化反应如体物的粗提物提闻大肠杆菌合成原花色素的方法。
技术介绍
原花色素(Proathocyanidins),也叫原花青素,是类黄酮的一种。原花色素是清除自由基最强的抗氧化剂之一，能保护大脑与神经组织，改善血液循环，灵活关节和年轻皮肤的作用。长期食用高含原花色素的食品，可以缓解心血管等疾病。科学家还发现原花色素及其衍生物还具有抗炎、抗逆境、抗肿瘤以及免疫调节的功能，可见原花色素素是一种极具 潜力的天然药物，消费需求越来越大。目前原花色素的主要来源是从植物组织部分提取，但植物生长需要较长的时间，原花色素的含量不高且提取工艺比较复杂，产率低，使得原花色素的大规模商业化生产受到了限制。由于原花色素人工合成难度较大，产量低，成本高，可行性不强。我们在前期的研究中发现芥菜型油菜基因DFR (dihydrofIavonoI 4-reductase,4-二氢黄酮醇还原酶)和BAN (anthocyanidin reductase,花色素还原酶)的表达量与油菜种皮原花色素的含量呈正相关。经对现有技术文献检索发现YanY J等(2008)在《生物工程与生物技术》(Biotechnol. Bioeng. 2008; 100: 126 - 140)上报道了利用在大肠杆菌中表达拟南芥、非洲菊(Gerbera),矮牵牛(Petunia)、金鱼草(Antirrhinum)中的花色素(Anthocyanin)合成途径中的基因可以提高大肠杆菌花色素的合成量，花色素和原花色素都属于类黄酮类物质，但未见有采用油菜原花色素合成基因来提高大肠杆菌原花色素的合成量的报道。花色素还原酶BAN是原花色素合成途径中的一个关键酶，花色素还原酶的活性越高，越有利于合成原花色素，采用基因工程手段，用基因BAN及其前体物质合成的关键酶DFR共转化大肠杆菌，将打破原花色素生物合成限速的瓶颈，从而获得原花色素高产的菌株，为规模化生产原花色素素提供一条新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种采用基因BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本专利技术涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、原花色素提取及含量测定。本专利技术建立了提高大肠杆菌中产原花色素的方法，为利用转基因大肠杆菌大规模生产原花色素奠定坚实的基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种采用芥菜型油菜基因BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤 (I)从芥菜型油菜种皮的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因和4-二氢黄酮醇还原酶DFR基因；(2)把BAN基因和DFR基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含BAN基因和DFR基因的原核表达载体pET-BAN-DFR ； (3)将BAN和DFR基因同时导入DH5α大肠杆菌，转化菌在LB液体培养基中，25-37°C，150-250rpm(转/分钟)培养6_14小时后，再在含黑色大豆种皮提取物的LB液体培养基中，25-37°C，150-250rpm震荡培36-54小时后，在室温下，离心力为10000-12000g离心收集菌体； (4)采用DMACA-HC1法测定大肠杆菌所含的原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高基因大肠杆菌菌株。步骤(3)中，所述的LB液体培养基中含有O. 5-1. Og/L黑色大豆种皮提取物。所述的黑色大豆种皮提取物的提取方法将黑色大豆种皮用粉碎机粉碎，过1.0 mm的筛，将用30%-70%的乙醇(v/v)作为萃取溶剂，大豆种皮量与溶剂用量之比为I : 4-8(w/w)，萃取温度为60°C-70°C，萃取时间为4-8小时；回收乙醇后的浓缩液 在8000-10000g的离心机中离心10-15min，过滤去杂，然后在浓缩液中加入丙酮，浓缩液与丙酮之比为I : l-3(v/v)，搅拌混匀2-5min，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在400C -60°C下真空干燥即得大豆种皮提取物。本专利技术的BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，是采用基因工程方法，将关键酶基因BAN和DFR导入大肠杆菌中，获得了原花色素含量显著提高的转基因大肠杆菌株，共转BAN和DFR基因大肠杆菌中原花色素的含量最高可达到12. 8mg/gFW(鲜重)，是同种培养基下非转化普通大肠杆菌的(0.4-0. 9mg/g FW)的8. 8-19. 8倍，该专利技术对于为原花色素规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。具体实施例方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于本实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等的《分子克隆实验室手册》(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989),郑伟娟等的《现代分子生物学实验》(北京高等教育出版社，2010)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。(一)油菜BAN和DFR基因的克隆 I.芥菜型油菜(Brassica juncea )种皮总RNA的提取 取少量芥菜型油菜紫叶芥授粉后15-25天的种皮，具体操作按严明理等(严明理，刘忠松，官春云，陈社员，刘显军.一种提取高质量油菜种子和种皮RNA的方法.生物技术通报· 2007，6:97-100)的方法进行总RNA的提取。2.芥菜型油菜BAN和DFR基因的克隆 将所获的油菜种皮总RNA通过反转录酶(AMV)反转录获得第一链cDNA，根据所述芥菜型油菜DFR基因的编码序列(序列表中的序列I)和BAN基因的编码序列(序列表中的序列2)，分别设计扩增出完整编码序列的上下游引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(根据选用的载体而定)，以便构建表达载体。以所述的第一链cDNA为模板，经PCR扩增后，产物连接到PMD18-T克隆载体后进行测序。DNA序列测定由生物公司采用3730测序仪完成。测序结果表明，所克隆的序列与预测的DFR (序列表中的序列I)和BAN基因(序列表中的序列2)的编码序列一致。采用基因克隆方法从芥菜型油菜中获得序列正确的原花色素生物合成关键酶基因BAN和DFR，为通过双关键酶基因共转化策略提高大肠杆菌中原花色素含量提供了两个重要关键酶基因。(二)含BAN和DFR基因的植物双元表达载体的构建 选用pMD18-BAN、pMD18_DFR和pET为基本元件，构建载体pET-BAN-DFR，具体的操作参考文献(Yan YJ, Li Z, Koffas MA. High-Yield Anthocyanin Biosynthesis inEngineered Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2008, 100: 126 - 140)中报道的方 法进行. 将原花色素生物合成途径关键酶基因BAN和DFR可操作性地连接于表达调控序列，形成含BAN和DFR基因的原核表达载体，该表达载体可用于通过代谢工程策略来提高大肠杆菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用芥菜型油菜基因BAN？和DFR？共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）从芥菜型油菜种皮的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因和4？二氢黄酮醇还原酶DFR基因；（2）把BAN？基因和DFR？基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含BAN？基因和DFR基因的原核表达载体pET？BAN？DFR；（3）将BAN和DFR基因同时导入DH5α大肠杆菌，转化菌在LB液体培养基中，25？37℃，150？250rpm(转/分钟)培养6？14小时后，再在含黑色大豆种皮提取物的？LB液体培养基中，25？37℃，150？250rpm震荡培36？54小时后，在室温下，离心力为10000？12000g离心收集菌体；（4）采用DMACA？HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高基因大肠杆菌菌株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严明理，刘丽莉，向建华，屠波，王帅斌，
申请(专利权)人：湖南科技大学，
类型：发明
国别省市：
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