本发明专利技术公开了一种控制甘蓝型油菜菌核病基因及其应用，具体涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因BnWRKY33的分离克隆、功能验证和应用。BnWRKY33基因具有控制作物菌核病的功能，在菌核病处理甘蓝型油菜时BnWRKY33的表达量显著提高。通过基因工程技术提高BnWRKY33基因的表达量能够控制油菜菌核病，从而对提高甘蓝型油菜及其他作物的菌核病抗性和产量具有重要的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
—种控制油菜菌核病的基因及其应用
本专利技术涉及一种控制油菜菌核病的基因及其应用，具体涉及一种控制甘蓝型油菜菌核病的基因和含有该基因或其同源基因的载体，并涉及利用该基因或其功能类似物调控植物抗菌核病在农业生产中的应用，属于植物基因工程领域。
技术介绍
油菜作为一种重要的油料作物，在中国的油料生产中占有重要的地位。我国油菜年种植面积700万公顷(I亿亩)，占全世界的1/3，居世界首位，其所产菜籽油占我国整个食用植物油供应的40% (沈金雄等，中国油菜生产及遗传改良潜力与油菜生物柴油发展前景[J]，华中农业大学学报，2007年，26卷6期894-899页)。此外，菜籽油也是适宜于生产生物柴油，油菜已被欧美各国作为解决全球能源短缺的重要原料作物。因此油菜不仅是食用油的主要来源，也是解决全球能源短缺的重要原料作物，具有十分重要的战略地位。然而，我国的菜籽生产量目前仅能满足国内2/3的消费需求，大量依赖进口。我国2005年进口植物油600多万吨，是世界上最大的油料进口国，随着人口数量的增长和人民生活水平的提高，按目前的生产规模，缺口将会变得更大(王汉中，中国油料产业发展的现状、问题与对策[J]，中国油料作物学报，2005年，27卷4期100-105页)。在当前和今后相当长的时间内，我国都将面临食用油和化石能源短缺的严峻局面。油菜菌核病(5b7<9roii/?iasclerotiorum (Lib.) de Bary)是限制我国油菜生产的主要因子之一。在长江中下游及东南沿海油菜主产区，油菜菌核病的发生率很高，产量损失高达50%以上；全国发生面积在7000万亩以上，产量损失高达30%，严重时达到50-80%。目前油菜菌核病的防治方法主要是化学防治技术和抗病品种的选育，但化学防治存在防效不高、病原难以根除、花期喷药困难以及农药残留、环境污染等诸多问题；常规育种因难以找到有效的抗性材料以及速度非常缓慢等缺点，也很难有效解决抗病问题。由此，对抗菌核病油菜品种进行分子改良，快速培育抗菌核病品种，是提高菜籽单位面积产量的重要策略。基因工程方法是按预先设计好的目标和计划，通过遗传操作，在分子水平上改良品种的技术。中国农业科学院作物科学研究所发现了一个植物抗病基因为基因a或基因b，将基因a或基因b修饰后对植物的抗性有显著提高(申请号:201110048518.9，2011)。而像油菜菌核病这类在寄主植物种内难于找到抗原的病害，基因工程方法提供了一种解决问题的途径。 WRKY转录因子家族是近年来研究较广泛的一类重要的转录因子，它存在于整个绿色植物系中，在调控植物生物胁迫反应及其相关信号转导途径中具有重要作用(AsaiT et al.,, MAP kinase signalling cascade in Arabidopsis innate immunity [J],Nature, 2002年，415卷6875期977-983页)。FMTJJ转录因子是WRKY转录因子家族中的重要一员，含有两个WRKY蛋白结构域，属于第I类WRKY蛋白(Eulgem et al.，The WRKYsuperfamily of plant transcription factors[J], Trends Plant Sci,2000 年，5 卷 5期199-206页)。已有研究表明转录因子是腐生型真菌抗性所必需的，它能够与(T) TGACC(A / T)序列(w-box)发生特异性作用，调节启动子中含W — box元件的调苄基因或功能基因的表达(Lippok B et al., Expression of AtWRKY33 encoding a pathogen-or PAMP-responsive WRKY transcription factor is regulated by a composite DNAmotif containing W box elements[J] ,Mol Plant Microbe Interact,2007年，20卷4期420-429页)。中国科学院植物研究所研究发现，WRKY的多肽Glyma02g39870能够调控植物中水杨酸的合成，从而增强植物的抗病性(金京波等，2012 ;申请号:201010541600.0)。拟南芥通过遞与AtMPK4形成一个复合体，当受到病原菌侵害时，AtWRKY33和AtMPK4从AtMKSl中脱离，从而引起下游一些激素相关的基因，如PRl、TOF1.2等的表达(Jin-Long Qiu et al, Arabidopsis MAP Kinase 4 regulates gene expression viatranscription factor release in the nucleus [J], EMBO Journal, 2008 年，27 卷 16 期2214 - 2221页)。将大白菜过表达后，大白菜呈现出对软腐病一定的抗性(范荣伟等，大白菜份fMTJJ基因上游调控序列的克隆及其功能研究[J]，农业生物技术学报，2010年，18卷4期670-675页)。而对于油菜的作用，目前还未见有文献及专利的报道。在本研究中我们发现，菌核病对油菜胁迫处理之后，的表达显著提高，进而，甘蓝型油菜转基因过表达植株显著增强菌核病抗性，这一结果在增强油菜菌核病抗性和提高菜籽油产量上具有重要的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种控制作物菌核病的基因BnWRKY33。一种来源于油菜的基因及其核苷酸序列为SEQ ID N0.1所示。本专利技术还公开了基因编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所/Jn ο本专利技术还公开了带有BnWRKY33基因的重组载体1300-35S-WRKY33-N0S。在载体pCAMBIA1300 (购于北京鼎国昌盛生物公司)的上游EcoRI/Kpnl酶切位点处加入CaMV35S强启动子，其下游BamHI/Hindlll酶切位点处加上CaMV Nos终止子，将其改造成载体pCAMBIA1300-35S-Nos。而重组载体 1300-35S-WRKY33-N0S 热:X BnWRKY33_? (5' -ggtaccATGGCTGCTTCTTCCCTTC-3' ) ,BnWRKY33~R{^' -ggatccTCAAGACAAAAACGAATCAAAG-3')为引物扩增出目的基因及?腸，进而按照gateway试剂盒(Gateway? LR Clonase?II EnzymeMix , Invitrogen Corporation)操作，将目的基因克隆到 pCAMBIA1300-35S_Nos 的酶切位点 KpnI/BamHI，得到 1300-35S-WRKY33-N0S。本专利技术进一步提供了所述BnWRKY33基因在提高油菜对菌核病的抗性中的应用，本专利技术通过过量表达该基因来达到提高甘蓝型油菜对死体营养型病菌菌核病的抗性。具体实验技术步骤如下: 创建甘蓝型油菜cDNA文库，从cDNA文库中PCR扩增出与AtWRKY33同源的cDNA，进行测序，发现这个cDNA克隆为1452bp,在GenBank数据库对其Blast核苷酸比对,发现这个cDNA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种控制油菜菌核病的基因，其序列为SEQ ID No．1 所示核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种控制油菜菌核病的基因，其序列为SEQ ID N0.1所示核苷酸序列。2.一种控制油菜菌核病的基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。3.一种重...
【专利技术属性】
技术研发人员：王政，方和娣，谭小力，陈克平，张志燕，陈宇，李冠英，顾守来，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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