本发明专利技术公开了一种醛酮还原酶突变体、基因、工程菌及在制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第295位、第296位进行单突变或双突变获得的；与野生型醛酮还原酶相比，本发明专利技术提供的Kluyveromyces lactis醛酮还原酶突变体，不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯催化比酶活大幅度提高，从0.56U/mg提高到7.95U/mg，提高了14.2倍，并且产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯非对映体选择性维持在99.5％以上；本发明专利技术所获得的多个醛酮还原酶突变体特别适合于催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具有较好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种阿托伐他汀双手性中间体的制备方法，特别涉及一种乳酸克鲁维酵母醛酮还原酶突变体和编码基因、载体、重组工程菌，以及该醛酮还原酶在不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯制备阿托伐他汀双手性中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用。(二)
技术介绍
6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，是阿托伐他汀合成工艺路线中的重要手性中间体，也是关键的药效基团。由于各国药监部门对药物手性纯度设置严苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的合成技术成为阿托伐他汀合成的关键核心技术。传统的6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯化学合成工艺从酮酸(酯)出发，通过不对称合成构建手性中心，反应路线复杂，需要使用易燃易爆的硼烷、正丁基锂等及深冷等特殊环境，导致产物d.e.值低、得率低、能耗大。而且，反应产生的硼化物废物处理困难，需要经过繁琐的反复甲醇淬灭、真空蒸馏处理。酶具有优异的选择性、反应条件温和，一般在常温、常压及近中性条件下进行，把分解、异构化、外消旋化、重排等不利副反应降到最低限度，生物催化技术具备提高过程原子经济性、实现过程绿色环境友好的基本条件。因此，开发生物不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯技术，具有巨大的经济效益和社会效益。醛酮还原酶超家族是一类NAD(P)H依赖型氧化还原酶，广泛分布于动物、植物和微生物细胞内，参与细胞内代谢反应，消除环境中有害物质对细胞的不良影响。目前已发现的醛酮还原酶已超过190种，分布于16个家族。醛酮还原酶通常为约320个氨基酸组成单亚基蛋白，大小为34-37kDa，具有(α/β)8筒状结构，其催化四联体由酪氨酸(Tyr)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)和赖氨酸(Lys)构成，底物作用谱宽，包括脂肪族和芳香组醛和酮、单糖、类固醇及前列腺素等。目前已有许多醛酮还原酶基因被克隆并在外源宿主中表达广泛用于不对称合成手性中间体，其中一些被用于不对称还原合成阿托伐他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。我们已经从乳酸克鲁维酵母KluyveromyceslactisCCTCCM2014380克隆得到的醛酮还原酶KlAKR，并在大肠杆菌(Escherichiacoli)实现异源过量表达(EnzymeandMicrobialTechnology2015,77:68-77)。该酶能够催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，产物de值大于99％。但该酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的活力并不高，从而限制了其工业化应用。通过已报道的醛酮还原酶晶体结构，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的氨基酸位点，通过定点突变技术提高醛酮还原酶对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力，将具有较强的工业应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是针对之前报道的醛酮还原酶KlAKR对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原活性较低的问题，提供一种醛酮还原酶突变体蛋白质及其编码基因，含有该基因的重组表达载体和重组工程菌，将表达该醛酮还原酶突变体的重组工程菌破碎之后的粗酶液作为催化剂催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原反应，制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。与野生型醛酮还原酶相比，本专利技术提供的醛酮还原酶突变体具有更高的催化活性。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种醛酮还原酶突变体，所述醛酮还原酶突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第295位、第296位进行单突变或双突变获得的，优选所述醛酮还原酶突变体是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第295位进行单突变或对第295位和第296位进行双突变获得的。进一步，优选所述单突变是将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变为色氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO.2所示，核苷酸序列为SEQIDNO.5所示；所述双突变为将SEQIDNO.1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变为色氨酸，并将第296位色氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO3所示，核苷酸序列为SEQIDNO.6所示。本专利技术使用定点饱和突变技术对醛酮还原酶KlAKR编码基因进行突变，连接表达载体后转化宿主大肠杆菌，诱导表达后再通过高效液相检测方法将活性提高的正突变检出。获得的突变体能催化(1～50g/L)6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称还原，制备光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具体方法如下：来源于K.lactisCCTCCM2014380克隆得到的醛酮还原酶KlAKR(GenBankaccessionnumber:KU145407)由309个氨基酸残基组成，已成功构建表达载体pET28b-klakr，功能正常的酶蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中实现过量表达。然后经过同源建模和分子对接，根据最优构象选择潜在的可能影响酶活性的位点。设定定点饱和突变位点，再设计并合成适当的引物，以所述的含亲本醛酮还原酶基因的重组表达质粒为模板，PCR扩增全长突变基因的质粒。通过将含有全长突变的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高活性的阳性突变子。最后从阳性突变子中抽提出质粒DNA，进行DNA测序分析，以确定引物的突变。在本专利技术醛酮还原酶突变体的制备中，可以采用任何合适的载体。本专利技术还提供一种所述醛酮还原酶突变体编码基因，所述醛酮还原酶突变体编码基因构建的重组载体及重组基因工程菌，优选所述重组质粒是pET28b；所述宿主细胞是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。本专利技术还涉及醛酮还原酶突变体编码基因在制备重组醛酮还原酶中的应用，所述应用为：构建含所述醛酮还原酶突变体基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主菌(优选大肠杆菌)中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组醛酮还原酶的菌体细胞，与野生型醛酮还原酶相比，具有更高的催化活性。本专利技术还涉及一种所述醛酮还原酶突变体在制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯中的应用，具体所述的应用以含醛酮还原酶突变体基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯为底物，以含本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第295位、第296位进行单突变或双突变获得的。
【技术特征摘要】
1.一种醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体是将SEQIDNO.1所
示氨基酸序列的第295位、第296位进行单突变或双突变获得的。
2.如权利要求1所述醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体是将SEQ
IDNO.1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变为色氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO2
所示。
3.如权利要求1所述醛酮还原酶突变体，其特征在于所述醛酮还原酶突变体是将SEQ
IDNO.1所示氨基酸序列的第295位酪氨酸突变为色氨酸，并将第296位色氨酸突变为亮
氨酸，氨基酸序列为SEQIDNO3所示。
4.一种权利要求1所述醛酮还原酶突变体编码基因。
5.一种权利要求4所述编码基因构建的重组载体。
6.一种权利要求5所述重组载体构建的重组基因工程菌。
7.一种权利要求1所述醛酮还原酶突变体在制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯
中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用以含醛酮还原酶突变体基因的
重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁
酯为底物，以含葡萄糖脱氢酶基因的工程菌发酵培养获得的葡萄糖脱氢酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚军，罗希，沈炜，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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