一种来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因制造技术

本发明专利技术公开了一种来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因，其序列具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。该序列是一种新的PAL基因序列，是人们对PAL基因的研究除兰科植物的霍山石斛和铁皮石斛兰外的一种新的植物。本发明专利技术还公开了一种上述源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因序列的克隆方法。

A source in Anoectochili phenylalanine ammonia lyase gene

The invention discloses a from Anoectochili phenylalanine ammonia lyase gene, the sequence with the nucleotide sequence of SEQ ID NO.1 said. This sequence is a new PAL gene sequence. It is a new plant in addition to Orchidaceae, Mount Holyoke Dendrobium and Dendrobium officinale, which have been studied in PAL gene. Cloning method of the present invention also discloses the source to Anoectochili phenylalanine ammonia lyase gene sequence.

【技术实现步骤摘要】
一种来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因
本专利技术属于植物基因工程
，特别涉及一种来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因。
技术介绍
金线莲（Anoectochilusroxburghii）是多年生草本植物，生长在福建、台湾、广东、广西、海南、四川、贵州、云南等亚热带及热带地区，属兰科开唇兰属金线莲种。金线莲中重要药理活性的物质主要为：黄酮类化合物，甾体类化合物，三萜类化合物，糖类成分，生物碱，强心甙类，酯类，牛磺酸，多种氨基酸，微量元素及无机元素等。在民间素有“药王”、“金草”、“神草”、“鸟人参”等美称。其中，金线莲中的黄酮类化合物主要包括槲皮素和异鼠李素。黄酮类化合物的合成直接影响了金线莲的药用价值。苯丙氨酸解氨酶(PAL)是在次生代谢酶类中研究较多、较早、最详尽的酶，它把植物的次生代谢与初生代谢联系起来，是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶。对金线莲中黄酮类化合物合成上游苯丙氨酸代谢途径的苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的克隆的研究，是研究金线莲中特定的目的次生代谢产物（如槲皮素和异鼠李素）富集的基础，具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对药用植物金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因开发研究的局限性，提供一种来源于植物金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因，该基因序列具有如SEQIDNO.1所述的核苷酸序列。SEQIDNO.1：GCATCCGATTCGAAATCCTGGAGGCCATTACCAGCCTCCTCAACAGCAAGATTACGCCTTGCCTGCCGCTGAGGGGAACCATCACCGCCTCCGGCGATCTTGTTCCTCTATCTTACATTGCGGGTGTCTTAACCGGCCGTCCCAATTGCAAGGCTATAACAGCCGACGGTGTTATTGTCAACGCAGTAGAGGCCTTCCGTCTTGCAGGAATCTCTAGCGGGTTCTTCGATCTTCAGCCCAAGGAAGGGCTCGCACTTGTCAATGGAACCGCCGTCGGCTCCGGCTTCGCCTCCATTGTCCTGTTCGAGGCAAACATCCTCGCCGTTATGGCAGTGGTTCTCTCTCTCTGTTTTGCGAGGTGATGCAGGGGAAGCCAGAGTTCACCGACCACCTCACCCACAAGCTCAAGCACCCCCCAGGCCAGATTGAGGCCGCCGCCACCATGGAGCACATACTCGACGGCAGCTCTTACATGAAGACGGCGAAGAAGCTCCATGAACTGGACCCTCTCCAGAAGCCAAAACAGGACAGATACGCTCTTCGCACCTCGCCCCAATGGCTCGGCCCTCAGATTGAAGTCATACGAGCTGCGACGAAATCAATCGAAAGAGAGATCAACTCCGTCAACGACAACCCCCTCATCGATGTCTCGAGGAATAAAGCTCTCCATGGCGAAAATTTCCAAGGAACCCCCATTGGCGTCTCCATGGACAACACCAG本专利技术的优点在于：以同源扩增拼接的方法得到金线莲中PAL基因的中间片段，这是一种新的PAL基因序列。同时，这种扩增未知序列的方法操作简单方便。附图说明图1为金线莲PAL基因中间片段电泳检测结果图。其中1为引物ZU1\ZD3扩增片段电泳结果。图2金线莲PAL基因同源扩增电泳检测结果图。注：1为引物ZU1\ZD1扩增片段电泳结果，2为引物ZU2\ZD2扩增片段电泳结果，3为引物ZU3\ZD3扩增片段电泳结果。图3金线莲与B.finlaysoniana中PAL基因相似性比对图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术的上述
技术实现思路
作进一步的详细描述。但不应该将此理解为本专利技术上述主题范围仅限于下述实验例。在不脱离本专利技术上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本专利技术的范围内。在下述各项实验例中，将金线莲的苯丙氨酸解氨酶简称为AnPAL。通过实验例，最终得到来源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶序列（如SEQIDNO.1所示）。实施例1本实施例为金线莲总叶片RNA的提取和纯化，总RNA提取使用北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAOUT2.0提取试剂盒，CAT#90404-50，包括下述步骤。估计组织细胞的用量。每次微量提取一般需要100-120mg植物叶片。先将新鲜植物组织剪成小块（保存在RNALOCKER中的植物组织需用纸吸取RNALOCKER液体后再剪成小块），放入10-15ml塑料离心管中，加入1ml65℃预热的溶液A（用前需要摇晃均匀），然后用匀浆器匀浆5-20s。匀浆时会产生泡沫，但不影响提取效果。也可以使用液氮现磨法破碎植物组织，现磨完成后加入1mL溶液A，但效果比较差，因为研钵本质是二氧化硅，在溶液A存在时会吸附RNA。将匀浆物或研磨物转移至干净的1.5ml塑料离心管中（可以不必转移非液体的细胞碎片）。有的植物组织（比如果实）含有大量水分，匀浆液会多于1ml，转移时也只取1ml。在离心管中加入0.3ml的溶液B和0.2自备氯仿，在震荡器上震荡30s混匀，此时溶液呈均匀的乳浊状。振荡器震荡时必须使管底溶液震荡起来。室温12000rpm离心3-5min，两相间约有5mm厚的细胞破碎物。将上清液（约0.6ml）转移到另一干净的1.5ml塑料离心管中，下层有机相和中间层含有DNA、蛋白质和其他杂质，避免触及吸取。最好留下100ul上清液不取。加入等体积的溶液C，充分颠倒混匀。将一半溶液转移到离心吸附柱（60911B）中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。注意不要跟用于RNA提取的吸附柱（60911D）混用。将剩下的一般溶液转移到同一离心吸附柱中，12000rpm室温离心半分钟，弃穿透液。将0.7ml通用洗柱液加入到离心吸附柱中，12000rpm室温离心10-30s，并弃穿透液。12000rpm室温离心10s，以便除去残留液体。将10ul（10U）的RNase-freeDNase加入到50ul37℃预热的DNA膜反应液中，吹打混匀配制成DNase工作液。将DNase工作液用37℃预热1min，然后全部加入到离心吸附柱中，室温放置5min。注意：5min一般足够降解大多数情况下的DNA污染。如果有DNA没有彻底降解（可能由于样品中残留的杂志抑制了DNase的活性），此步的保温时间可以适当延长到10min或15min。直接在离心吸附柱中加入0.7ml通用洗柱液，盖上盖后颠掉数次混匀。1200rpm室温离心半分钟，并弃穿透液。再加0.3ml通用洗柱液到离心吸附柱，12000rmp室温离心半分钟，弃穿透液。12000rpm室温离心半分钟。此步十分重要，否则残留乙醇会影响到RNA的使用。将离心吸附柱转移到RNase-free收集管中，加入30-50ulRNA洗脱液，室温放置1-2min。12000rpm室温离心半分钟，离心管中溶液即为RNA样品。本产品提供的离心吸附柱吸附力强，一次洗脱不能全部将膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种源于金线莲的苯丙氨酸解氨酶基因，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨琳，张君诚，付凤玲，李晚忱，宋育红，
申请(专利权)人：三明学院，
类型：发明
国别省市：福建,35