能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂制造技术

本发明专利技术为一种能表达活性苯丙氨酸酶的基因工程菌口服制剂，该制剂经过以下步骤制成：从植物中抽提总ＲＮＡ，构建能表达有活力的苯丙氨酸脱氨酶的ｃＤＮＡ的工程菌，宿主菌选用人小肠正常菌群，包括乳酸杆菌、乳球菌及双歧杆菌等，进而制成口服制剂。该制剂进入人体小肠后，使来自食物消化的ｐｈｅ在其被吸收之前被ＰＡＬ脱氨，变成对人体无害的肉桂酸，对经典型苯丙酮尿症能够达到与低ｐｈｅ饮食疗法相同的疗效，服用方便，安全可靠。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种采用基因重组等分子生物学技术，构建能表达有活力的苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌，进而制成口服制剂的方法。经典型苯丙酮尿症(Phenylketonuria)是在我国及世界各国均常见的导致患儿智力低下、呆傻的遗传病。现行的治疗方法主要是，对在新生儿筛查中发现的患儿立即给予特制低苯丙氨酸(Phenylalanine，简phe)含量的奶粉，而不能吃母乳及牛奶等一切富含phe的正常食品，直至其智力发育基本正常，有的需要十几年时间。这种特殊饮食疗法不但价格昂贵，而且时间长，难以持久。有少数用苯丙氨酸脱氨酶(PhenylalanineAmmonia-lyase，简称PAL)进行试验性治疗的研究报告，但该酶不稳定，价格贵，尚无临床应用价值。另外，现行的基因治疗方法一般是设法使正常的苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因在患儿肝脏表达，以替代其有缺陷的PAH基因发挥功能。该方法存在着载体选择、给药方式、长期服用安全性及伦理学上等一系列困难，尚有待解决。本专利技术的目的在于利用基因工程技术，提供一种能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，该制剂进入人体小肠后，使来自食物消化的phe在其被吸收之前被PAL脱氨变成对人体无害的肉桂酸，从而能够达到与低phe饮食疗法相同的疗效，安全可靠，价格低廉，易于为患儿接受。本专利技术提供的能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，通过以下方法得到1、从植物中抽提总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术，制备完整PAL的cDNA，并使其两端带上适当的限制性内切酶识别序列，用相应的限制性内切酶酶切该cDNA，克隆到pBluescript载体上，获得pBS PAL1(参见图2-4)；2、将原核表达载体PET23b、pMG36e等，用适当限制性内切酶酶解，纯化出经酶切具适当末端的载体DNA片段；3、将上述制备好的PAL cDNA片段与原核表达载体片段在T4DNA连接酶催化下进行连接；4、用上述连接混合物转化感受态宿主菌细胞，所说的宿主菌为人类肠道正常菌群；5、用特异引物的PcR筛选含完整PAL cDNA的阳性克隆，并用限制性内切酶图谱鉴定其正确性；6、用高压液相层析HPLC检测到所得的阳性克隆工程菌，PET23b-PAL、pMG36e-PAL、pMG36e-s-PAL等能将外加苯丙氨酸转化为肉桂酸，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可见到一条分子量约为70KD的蛋白产物带，即苯丙氨酸脱氨酶；7、将上述能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌制成口服制剂。下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步说明。实施例1、从受机械损伤的欧芹茎叶中抽提总RNA，用RT-PCR技术制备PAL的cDNA，用SnaBI和XbaI消化PAL cDNA，得到2.4Kb的具有XbaI粘性末端和平末端的PAL cDNA片段；用EcocRI和XbaI酶解穿梭质粒pMG36e DNA，得到具XbaI粘性末端和平末端的载体DNA；将二者重组连接。转化感受态E.Coli，得到PALcDNA插入方向正确的大肠杆菌表达株pMG36e-PAL；用PCR法及XbaI，/HindIII酶切分析均证实其正确性。如图2所示，每ml该大肠杆菌工程菌培养液(NZCYM)中加入phel.25mg，37℃保温不同时间后，用HPLC分析培养液中肉桂酸，发现其浓度逐渐增大，说明pMG36e-PAL确实能将phe脱氨而生成肉桂酸(见附图说明图1)。用电穿孔技术(Electroporation)将重组质粒pMG36e-PAL转导进乳酸杆菌(Lactobacillus)、乳球菌(Lactococcus)及双歧杆菌(Bafitobacterium)，分别得到能表达活性PAL的乳酸杆菌工程菌pMG36e-PAL-L、乳球菌工程菌pMG36e-PAL-LC、双歧杆菌工程菌pMG36e-PAL-B，将它们送入高苯丙氨酸血症大鼠肠道，均检测到大鼠外周血中phe浓度显著下降(见图2所示)。2、制备2.4Kb具有平末端及XbaI粘性末端的完整PALcDNA。用SacI和XbaI双酶解pMG36e质粒DNA，用DNA合成及递归PCR技术，制备长180bp，具SacI末端和平末端的含有能引导融合PAL蛋白从细菌细胞分泌到胞外的信号肽基因片段。这三种DNA在T4DNA连接酶作用下，便重组成含完整PAL cDNA，并在pp其上游区有一编码27个氨基酸的信号肽的基因片段。这一重组表达质粒，定名pMG36e-s-PAL。将其分别转化E.Coli，乳酸杆菌等宿主菌，筛选到其在大肠杆菌的工程菌pMG36e-s-PAL-E.Coli，在乳酸杆菌中的工程菌(pMG36e-s-PAL-L)，在乳球菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-LC，在双歧杆菌中的工程菌pMG36e-s-PAL-B，上述工程菌均能使phe脱氨而变成肉桂酸(见图3所示)。3、用NdeI和Bgl II酶解PAL-cDNA，制得具NdeI和Bgl II粘性末端的PAL cDNA。用NdeI和Bgl II处理原核表达载体pET23b，将二者在T4DNA连接酶作用下连接，转化感受态E.Coli，用pCR技术和酶切图谱法鉴定阳性克隆，即工程菌pET23b-PAL。PET23b-PAL工程菌裂解液经SDS-PAGE电泳分离，考马斯亮兰染色，可见工程菌经IPTG诱导后出现一条长约70kd的新的蛋白产物，与PAL理论分子量一致。说明该工程菌可诱导表达PAL。后者能将phe转化为肉桂酸(见图4所示)。本专利技术的优点体现在以下几方面1、安全，有效。用本专利技术基因工程菌口服制剂治疗苯丙酮尿症，外源基因及载体DNA不进入人体组织细胞内，绝无与人基因组DNA整合或激活诸如癌基因等的可能性。加之乳酸杆菌、双歧杆菌等本来就是人类肠道内有益的正常菌群，phe经PAL转化后的产物肉桂酸对人体亦无毒害。2、提高了患儿生活质量。苯丙酮尿症患儿及孕妇在服用本制剂期间，可与常人一样正常饮食。与食用十几年特制异味低phe奶粉的治疗方法相比较，本专利技术易于为苯丙酮尿症患儿、孕妇及家长所接受，患儿可吃到美味食品是其极大的幸福。3、用药方式简便易行，且可通过控制服药次数、剂量来调节肠内PAL活力，达到最佳疗效。4、市场大，用量大，经济效益可观。苯丙酮尿症虽发病率有限(约1/1.6万)，但全世界各国、各人种均有此病发生，且每个患者用药时间长达十几年，为本专利技术提供了广阔的应用前景。总之，本专利技术巧妙地避开了现行基因治疗所遇到的一系列难题，利用PAL这一本来与phe体内正常代谢无关的酶及人类肠道正常菌群，直接在小肠内设一小“药厂”，就地生产PAL，就地发挥药效，同时避开了现行基因工程药物的分离、纯化等后处理的难题。本专利技术中的图式说明图1工程菌PAL酶活性检测结果。图2组成性表达PAL示意图。图3分泌表达PAL示意图。图4诱导表达PAL示意图。权利要求1.一种能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，其特征在于通过以下方法得到(1)从植物中抽提总RNA，利用逆转录-聚合酶链反应RT-PCR技术，制备完整PAL的cDNA，并使其两端带上适当的限制性内切酶识别序列，用相应的限制性内切酶酶切该cDNA，得到具有适当末端的PAL cDNA片段；(2)将原核表达载体，用适本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能表达活性苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌口服制剂，其特征在于通过以下方法得到：（１）从植物中抽提总ＲＮＡ，利用逆转录－聚合酶链反应ＲＴ－ＰＣＲ技术，制备完整ＰＡＬ的ｃＤＮＡ，并使其两端带上适当的限制性内切酶识别序列，用相应的限制性内切酶 酶切该ｃＤＮＡ，得到具有适当末端的ＰＡＬ ｃＤＮＡ片段；（２）将原核表达载体，用适当限制性内切酶酶解，纯化出经酶切具适当末端的载体ＤＮＡ片段；（３）将上述制备好的ＰＡＬ ＣＤＮＡ片段与原核表达载体片段在Ｔ↓［４］ ＤＮＡ连接酶催化下 进行连接；（４）用上述连接混合物转化感受态宿主菌细胞；所说的宿主菌为人类肠道正常菌群；（５）用特异引物的ＰＣＲ筛选含完整ＰＡＬ ｃＤＮＡ的阳性克隆，并用限制性内切酶图谱鉴定其正确性；（６）用高压液相层析ＨＰＬＣ检测到所得的阳性克 隆工程菌，ｐＥＴ２３ｂ－ＰＡＬ、ｐＭＧ３６ｅ－ＰＡＬ、ｐＭＧ３６ｅ－ｓ－ＰＡＬ等能将外加苯丙氨酸转化为肉桂酸，用ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，可见到一条分子量约为７０ＫＤ的蛋白产物带，即苯丙氨酸脱氨酶；（７）将上述能表达活性苯丙氨酸脱 氨酶的基因工程菌制成口服制剂。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘敬忠，
申请(专利权)人：首都医学院附属北京红十字朝阳医院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]