抗虫转基因水稻T1c-19的培育方法技术

本发明专利技术属于水稻基因工程技术领域。具体涉及抗虫转基因水稻T1c-19的培育方法。利用合成的如SEQ ID NO：1所示新型杀虫基因cry1C为目标基因，以bar基因为选择标记基因，采用农杆菌介导的遗传转化法，将目标基因导入水稻优良恢复系明恢63中，获得高抗水稻鳞翅目害虫的新型转基因水稻材料T1C-19。此外，还可通过有性杂交和体细胞杂交技术将T19-1的抗虫基因重组到新的水稻种质中，在水稻转基因植株的外源基因插入片段的侧翼序列为SEQ ID NO：3所示的5’端侧翼序列，和/或SEQ ID NO：5所示的3’端侧翼序列，提供了完整培育成水稻抗虫新品种(系)的方法。本发明专利技术获得的T1C-19是一种新的遗传资源。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】抗虫转基因水賴Tlc-19的培育方法 本专利技术是申请号为2013101382916申请案的分案申请，原案申请日为2013年4月 19日。
本专利技术属于植物基因工程
，具体设及一种抗虫转基因水稻Tlc-19的培 育方法，本专利技术利用农杆菌介导的遗传转化技术将外源基因导入水稻受体品种从而获得转 基因抗虫水稚的方法。
技术介绍
苏云金芽胞杆菌度acillusthuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性菌，广 泛存在于±壤、尘埃、水域、沙漠、植物、昆虫尸体中（贾±荣等，2001)。1901年，日本学 者石渡从染病的家蚕体液中首次分离出Bt菌，并证明部分Bt对鱗翅目昆虫有杀虫活性。 二十世纪50年代，人们发现化菌的杀虫活性与伴胞晶体有关（Hannay1953)，并证实运 种伴胞晶体由蛋白质组成化annay和Fitz-James1955)。运种蛋白被称作5-内毒素 (5-endotoxins)或杀虫晶体蛋白（insecticidalCiystalprotein,ICP)。杀虫晶体蛋白 的分子量一般为130-140邸左右，其基因一般位于苏云金芽胞杆菌的质粒上。目前人们已 从不同的Bt菌的亚种中分离出对不同昆虫（如鱗翅目、銷翅目、双翅目、蛾类等）和无脊椎 动物（如寄生线虫、原生动物等）有特异毒杀作用的杀虫晶体蛋白。 化杀虫晶体蛋白本身不具有生物活性，称为原毒素（protoxin)。当昆虫吞食化y 晶体原毒素后，肠道中的碱性环境和大量的蛋白酶会将晶体蛋白水解成毒性肤。活化的毒 性肤的细胞结合区与肠道上皮细胞纹缘受体度BMV)结合，而毒性区作用于细胞膜，改变肠 道细胞膜离子的通透性，产生小孔，破坏渗透平衡，使细胞裂解，最终使昆虫厌食而亡。 化杀虫晶体蛋白一般为碱溶性，即需要在碱性条件下才能溶解，毒蛋白才能活化。 由于不同昆虫的消化道的抑环境不一样，所W它直接影响化杀虫蛋白的杀虫活性。Whyl 蛋白为例，其作用的鱗翅目昆虫的消化道抑值为抑10-11，在运种碱性条件下，化yl原毒 素的分子间二硫键被破坏，成为分子量为130-140kDa的原毒素度ietlotetal.，1990;Du etal. ,1994)。接着在昆虫消化道的一些蛋白酶的作用下，逐步除去C端的约60kDa和N 端的3-5kDa的结构片段，从而成为62-65kDa不被蛋白酶降解的活性毒素（Rajamohanet al. , 1998;Schnepfetal. , 1998!Rrutosetal. , 1999)。故原毒素能否激活是产生毒性的 首要条件。 1981年，Schnepf和怖iteley首次将化库斯塔克亚种（subsp.Kurstaki)菌株 皿-1中的杀虫晶体蛋白基因克隆到了大肠杆菌质粒中。随后，有学者将化基因转入烟草 (Adangetal. , 1987 巧artonetal. , 1987;Vaecketal. , 1987)、西红柿（Fischhoffet al.，1987)、棉花（Perlaketal. 1990)等获得了相应的抗虫转化基因植物。 阳007] 虫害是水稻的ryzasativaL.)生产的大敌，造成水稻减产、品质下降。其中， 危害水稻最主要的害虫是鱗翅目的二化惧（化ilosuppressalis)、S化惧（T巧pcxryza incertulas)和稻纵卷叶惧（Qiaphalocrocismedinalis)。二化惧和S化惧主要危害水稻 茎杆，在苗期和分葉期造成枯屯、；在孕穗初期侵入，造成枯孕穗；在孕穗末期和抽穗初期侵 入，造成白穗（Pathak, 1977)。稻纵卷叶惧则W幼 虫缀丝纵卷水稻叶片成虫巷，幼虫匿居其中取食叶肉，形成白色条斑。长期W来，惧虫主要 通过化学农药进行防治，不但增加了水稻生产成本，而且造成了环境污染、农药残留等问题 (PingaliandRoger1995)。 水稻是东南亚人民的主食作物，故发展转化水稻对于亚洲国家具有特殊意义。第 一，水稻的种植面积大，全球每年种植水稻面积超过了 1. 45亿公顷，而亚洲的种植面积占 总种植面积的90%W上，故发展转化水稻利益巨大。第二，水稻的主要害虫，如二化惧、= 化惧、稻纵卷叶惧等均为鱗翅目昆虫，在化蛋白的有效毒杀范围内。第=，通过大规模的筛 选，目前尚未在水稻中找到有效控制虫害的抗性基因资源。因此，通过转基因培育抗虫水稻 是解决上述问题的最有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种培育转基因抗虫水稻，尤其是抗虫转基因水稻Tlc-19 的培育方法。所述方法中基因转化的受体为水稻品种明恢63,所使用的目的基因为杀虫基 因crylC(其核巧酸序列见中国专利技术专利化02139081. 9文献和本说明书的序列表SEQID NO:1)，所获得的成果是抗虫转基因水稻事件Tlc-19的培育方法。 采用农杆菌介导的釉稻遗传转化法（参见专利号为化200410013344. 2文献），将 杀虫基因crylC导入受体水稻品种明恢63中。通过PCR分析对TO代转基因植株进行阳性 检测，Southern杂交确定不同转基因家系的拷贝数，W酶联免疫吸附法检测杀虫晶体蛋白 的含量，室内离体茎杆接虫结合田间自然发虫鉴定确定不同转基因家系的抗虫性。同时在 田间调查转基因植株的株高、分葉数、产量等农艺性状，最终获得外源基因单拷贝插入，高 抗水稻鱗翅目害虫且农艺性状与原品种没有显著差异的转基因水稻新材料。通过反向PCR 确定外源基因插到受体品种明恢63中的侧翼序列。该转基因抗虫材料可通过有性杂交和 体细胞杂交技术重组到新的水稻种质中去，进而培育获得抗虫水稻衍生新品种（系）。 本专利技术还公开了转化载体的构建，水稻遗传转化和转化植物的分子鉴定，插入位 点的序列分析，室内和田间抗虫试验W及农艺性状调查等过程。 本专利技术的具体步骤是： 一种培育提高水稻对惧虫抗性的转基因植物的方法，利用序列表SEQIDNO:1所 示的抗虫基因crylC，构建获得如图2所示的植物表达载体地arl3-化ylC，通过农杆菌介导 的釉稻遗传转化方法，将所述的表达载体地arl3-化ylC导入到水稻受体中，使其在转基因 水稻中表达crylC基因，通过在室内和田间检测转基因水稻对水稻惧虫的抗性，最终获得 高抗惧虫的转基因水稻植株； 其中：图2所示的植物表达载体地arl3-化ylC含有序列表SEQIDNO:1所示的核 巧酸序列。 其中的植物表达载体地arl3-化ylC含有SEQIDNO:1所示的核巧酸序列和图2 所示结构，该载体通过如下步骤构建而成： 先用化OI酶切图1所示PCAMBIA1300质粒载体，然后用T4DNA聚合酶抹成平末 端，连入bar基因形成中间载体地a;rl3,用化ndIII+BamHI双酶切地a;rl3后，连入玉米 化iquitin启动子，再用BamHl+SacI双酶切保存有crylC基因的PUC18质粒后，连入沈Q IDNO:1所示的crylC基因后，形成图2所示的新型植物表达载体地arl3-化ylC。 本专利技术利用上述方法获得的一个复合转基因结构，该转基因水稻植株Tlc-19基 因组的特定位点上携带了一种能稳定遗传的复合转基因结构，该特定位点位于水稻基因组 第11染色体，所述的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一个水稻转基因植株的外源基因插入片段的侧翼序列，所述侧翼序列为5’端序列，其特征在于：该5’端侧翼序列如SEQ ID NO：3所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林拥军，唐微，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42