一种人工设计的Ｂｔ抗虫基因及其应用制造技术

本发明专利技术人工设计出一条全新的Ｂｔ基因，命名为ｍＣｒｙ１Ａｂ，同时构建了ｍＣｒｙ１Ａｂ基因的表达盒和表达载体，并转化水稻。Ｃｒｙ１Ａｂ／Ａｃ试纸条检测结果显示，转基因植株体内存在ＢＴ毒蛋白，且ＢＴ毒蛋白的平均表达量达７．２３ｎｇ／ｍｇ。室内和田间抗虫性鉴定都显示转基因植株具有明显的抗虫效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因人工改造和生物防治
，具体涉及一种人工设计的Bt抗 虫基因，及其在鳞翅目害虫防治上的应用。
技术介绍
苏云金芽孢杆菌(Bt)的晶体蛋白可作为生物农药特异地毒杀某些昆虫。该晶体 蛋白被昆虫摄取后，在昆虫肠道的碱性条件下溶解产生130KD左右的前毒素分子，经肠道 蛋白酶水解前毒素的C端被降解，最后产生由N端65-70KD组成的毒蛋白。该毒蛋白的N 端一段残基(就CrylA而言为28个)进一步被肠蛋白酶加工去掉才能形成完全活化的毒 蛋白。活化的毒蛋白与敏感昆虫中肠上皮细胞上的受体结合，插入到中肠细胞膜上形成 0. 5 1. Onm的小空或离子通道，引起胞内离子的外渗及水的内渗，造成细胞溶胀破裂，大 量细胞遭到破坏，致使幼虫停止进食而死亡。研究证明，Bt晶体蛋白对人体、哺乳动物、鸟类、鱼类以及很多有益昆虫均无毒害 作用，所以Bt制剂已作为一种无公害的天然微生物杀虫剂在农业、林业及环境卫生等方面 应用了近50年。但由于自然条件下Bt晶体蛋白稳定性差，杀虫效果受天气影响大，易被太 阳照射降解，也不能渗透到植物组织内部，易被雨水冲刷掉；且其必须被昆虫取食到才能发 挥杀虫功能，这些限制因素使该生物杀虫剂的发展一直受到很大制约，所以目前对农业害 虫的防治还主要依靠化学杀虫剂。20世纪80年代中期，随着植物基因工程技术的成熟、Bt基因克隆的成功及对Bt 晶体蛋白杀虫剂机制研究的深入，使人们有可能将Bt基因转入植物获得可表达杀虫蛋白 的抗虫转基因植物。目前，全世界已有26种以上Bt转基因植物，包括棉花、玉米、水稻等主 要农作物。野生型Bt晶体蛋白基因在转基因植物中的表达量非常低。在CaMV 355启动子 驱动下其表达量约占总可溶性蛋白的0. 001%左右，不能使转基因植物获得毒杀多数对Bt 毒蛋白不太敏感的昆虫。并且来源于Bt的杀虫基因直接转入植物中还存在表达产物不稳 定的问题。1991 年，Perlark 等(FREDERICK J. PERLAK 等 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 3324-3328,1991)根据植物基因的密码子使用频率及可能影响植物mRNA稳定性的基序在 保持原Bt基因编码的氨基酸序列不变前提下，对Bt晶体蛋白基因Cryl Ab和Cryl Ac进 行了改造。改造的基因在转基因烟草和番茄中表达的杀虫蛋白量比野生型基因的表达量分 别提高了约10倍和100倍。然而，这种改造只是部分使用了偏好密码子，大部分氨基酸仍 使用了多个密码子(表3FM CrylAb基因)。同时，不同植物的密码子使用频率存在差异，以同是高等植物的单子叶植物 和双子叶植物为例，单子叶植物氨基酸密码子简并位(末位)偏向使用C或G，而双子 叶植物部分氨基酸密码子的简并位却偏向使用A或U(WiIbur H. Campbell等Plant Physiol. 199092,1-11)。因此，根据植物密码子的使用频率设计基因，在不同作物中表达量 也会存在差异，要想在特定作物中高量表达目的基因，应根据本作物的偏好密码子来改造目的基因。水稻是我国乃至世界的最重要粮食作物之一，每年由于大螟、二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等鳞翅目害虫危害，损失惨重。目前水稻田间生产，如果不使用化学农药防治鳞 翅目害虫，可使产量损失达60%左右。近年来，由于水稻基因组计划的完成，大大方便了水 稻基因序列和密码子信息的获得，使得分析水稻密码子使用频率成为可能。如能根据水稻 的密码子使用频率，挑选偏好密码子改造现有的BT毒蛋白基因，使其在水稻中稳定高效表 达，无疑具有重要意义。
技术实现思路
专利技术目的转基因技术可打破生殖隔离，实现不同物种间的基因转移。但是在一个物种高效 表达的基因，被转化到另一物种后，表达量不一定高，也不一定还能具有本来的功能，特别 是对于差异较大的物种。物种密码子偏好性是影响外源基因表达量的诸多因素之一。不同 的物种往往具有不同的偏好密码子。分析这种偏好性，在转基因之前，对需要转化的目的 基因进行密码子的重新设计或改造，将对提高外源基因在受体生物中的表达量具有重要作 用。CrylAb蛋白是一类由苏云金芽孢杆菌产生的对鳞翅目害虫具有毒害作用的伴胞 晶体。CrylAb基因在生物防治领域具有重要的应用前景。但是CrylAb基因来源于细菌(苏 云金芽孢杆菌)，直接应用到转基因植物中，表达量低，抗虫性效果差。分析苏云金芽孢杆菌和水稻的密码子使用情况，可以发现两者在密码子偏好上存 在很大差异，利用水稻的偏好密码子，重新设计和改造crylAb，以实现转新CrylAb基因水 稻具有较好的抗虫性。技术方案1、基因供体生物和受体生物间密码子使用频率和偏好密码子分析不同生物在密码子使用频率和偏好性方面存在差异，是影响外源基因在供体生物 和受体生物间表达差异的重要因素之一。本专利技术正是利用物种间密码子偏好性差异来改造 和设计基因的。本专利技术需要改造的基因为CrylAb，来源于苏云金芽孢杆菌(细菌)，转基因的受体 生物为水稻(单子叶植物)。分析水稻和苏云金芽孢杆菌的密码子使用频率结果见表1。从 表1中挑选出水稻和苏云金芽孢杆菌氨基酸使用频率最高的密码子(偏好密码子，表2)。 由表2可知，水稻和苏云金芽孢杆菌的偏好密码子存在很大差异，苏云金芽孢杆菌的氨基 酸偏好密码子第三位(末位)除亮氨酸(L)为G外，其它全部为A或T ；而水稻的偏好密码 子第三位全部为G或C，只有偏好的终止密码子第三位为A。水稻、苏云金芽孢杆菌密码子 的使用频率和偏好性差异是本专利技术进行CrylAb基因设计和改造的理论基础。2、目的基因的设计和序列分析用水稻偏好的密码子(表2)依次替换CrylAb蛋白的每个氨基酸，获得一个新的 基因(DNA序列)，该基因被命名为mCrylAb，序列见SEQ ID NO 1。分析mCrylAb与其他BT 基因间的DNA序列差异，验证mCrylAb是否为一个全新的基因。分析结果是mCrylAb与 CrylAb在DNA序列组成上有很大差异。CrylAb基因使用了 58个密码子，而mCrylAb基因只选用了 22种密码子(只有S和R两种氨基酸各选用了两个密码子，其它氨基酸都只有一 个密码子)；CryIAb基因的GC含量为37. 3%，而mCrylAb基因的GC含量为64. 7%;同源比 对结果显示，两个基因的同源性只有69. 38% (图1)，总共1845个碱基，有565个碱基存在 差异。GENBANK数据库中Blast结果显示无与mCryIAb基因完全一致的序列，最高同源序 列为gb :AY326434. 1，同源性仅为89% (1664/1852)。可见，mCrylAb为一个全新的基因。 3、目的基因的人工合成由于mCrylAb基因是人为设计的，在自然界中不存在这个序列，需要全人工合成。 本专利技术委托上海英俊公司按照mCrylAb基因序列进行全人工合成，并装载在pMD18_T载体 上，形成pMD18-mCrylAb载体。4、构建目的基因的植物表达盒或表达载体把目的基因装载到植物表达盒或表达载体上，为植物转化做准备。本专利技术所用到 的表达载体有两个，一个为PCAMBI1305. 1，用mCryIAb基因替换⑶S基因，形成一个新的载 体P3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人工设计的Ｂｔ抗虫基因，该基因核苷酸序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】
一种人工设计的Bt抗虫基因，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。2.一种表达盒，其特征在于引入了权利要求1描述的基因或DNA分子。3.—种表达载体，其特征在于包含权利要求2所述的表达盒。4.一种获得转基因植物或植物部分的方法，其特征是该方法应用了权利要求1-3所述 的基因、DNA分子、表达盒或载体。5.根据权利要求4所述的植物包括粮食作物、蔬菜作物、花卉作物、能源作物。6.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨剑波，宋丰顺，吕玉萍，李笑寒，倪大虎，陆徐忠，李莉，汪秀峰，张毅，李浩，尚玉花，段永波，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]