乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法技术

本发明专利技术公开了一种乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，属于生物工程技术领域。体外合成包括目的基因hBPI的CDS序列，该CDS序列上游添加了XhoI酶切位点、Kozak序列、牛β-酪蛋白信号肽，下游添加了XhoI酶切位点；并将此体外合成序列定向克隆至经XhoI酶切的pBC1-loxp-neo-loxp-pBD载体；经菌液PCR和测序验证，获得了构建正确的人杀菌/通透性增强蛋白乳腺特异表达载体pBC1-loxp-Neo-loxp-hBPI。本发明专利技术经细胞C-127水平的功能验证表明该载体基因构建合理、有效，这将为成功制作动乳腺生物反应器生产hBPI蛋白奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种，该方法用于制备转基因动物乳腺生物反应器。人杀菌通/透性增强蛋白(hBPI)是由Weiss等人于1978年首次从人中性粒细胞(PMN)的嗜苯胺蓝颗粒中分离得到，hBPI基因全长编码区包含1464个碱基对，翻译后由456个氨基酸残基组成分子量大小为55 60KD左右的蛋白，其结构与内毒素结合蛋白类似，它能与游离的LPS或革兰氏阴性菌细胞外膜膜LPS结合，结合所形成的BPI-LPS复合物能阻止LPS所引发的宿主细胞免疫应答反应，起到中和内毒素和杀灭细菌作用。人的PMNs (polymorphonuclear neutrophils)中诸多抗菌成分中，BPI是唯一既能够对革兰氏阴 性菌发挥杀菌作用又可以中和内毒素作用的抗菌肽类物质，而对革兰氏阳性菌和真核细胞没有杀伤作用，此外，BPI还有促进补体活化、增强吞噬调理作用，抑制血管生成、抑制炎性介质释放、减轻内毒素血症和防止休克发生等生物学作用，被称为“超级抗生素”。因其本身为人体抗菌成分，不会引起机体免疫反应，因此BPI在临床上具有广阔的应用前景。天然的BPI不仅来源有限，而且提取方法复杂、获得量低、价格昂贵，由于人们对蛋白结构与功能之间关系认识的局限，人工化学合成的BPI蛋白多为线性或含有简单二级结构的多肽，不能够很好的模拟杀菌和抗内毒素功能，BPI分子由于其抗菌活性，特别是抗革兰阴性菌活性，大肠杆菌不适宜作为其表达的宿主菌，因此其表达研究一直以真核细胞、酵母等真核表达为主，真核表达虽然具有活性高的优点，但产量较低、表达周期长、成本高。目前重组BPI及其衍生物在应用上存在着活性不高、半衰期短、用药剂量大，严重影响其临床应用。转基因乳腺生物反应器是指通过转基因技术将外源基因导入动物基因组并在乳腺特异表达重组蛋白，动物乳腺作为一个专门化的外分泌腺体，其天然高效合成、分泌蛋白的能力很强，可以对表达的蛋白进行一系列加工修饰，因而动物乳腺作为生物反应器生产重组蛋白具有活性高、产量高、易于纯化等优点，被认为是生产重组药用蛋白理想的“加工场”。当前，动物乳腺生物反应器研制面临的突出问题是成功率不高、表达水平偏低，试验周期较长，研制成本较高。基因构件是制备动物乳腺生物反应器上游关键材料之一，直接影响目的基因的表达水平。本专利技术要解决的技术问题是提供了一种。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是，，包括如下步骤(I)设计合成如下序列XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β -酪蛋白信号肽+人BPI的⑶S序列+XhoI酶切位点，体外合成并克隆至pUC57载体的EcoR V酶切位点处，命名为 pUC57-hBPI ；(2)使用限制性内切酶Sal I 分别酶切 pUC57-hBPI、pBCl-loxp-neo-loxp-pBD ;胶回收插入PUC57载体的体外合成的外源片段、pBCl-loxp-Neo-loxp片段；使用T4连接酶连接上述回收的片段；(3)上述连接产物转化至DH5 α感受态细胞中，涂布至氨苄抗性平板，挑单菌落摇菌；设计引物？1、？2、？3，使用菌液？0 法快速鉴定；所述引物具体情况如下上游 hBPI I : 5 ’ -ACCATGAAGGTCCTCATCCTT-3，，锚钉在插入序列的 5，末端；下游hBPI2 :5’ -ATAGACAACGTCTGCACCGAA-3’，锚钉在插入序列的 3’ 末端；上游hBPI3 :5’-TCTTTGGTTCCTTTTAAAG-3’，锚钉在载体上XhoI插入位点上游骨架序列匹配；下游hBPI4 :5’ -TCCATCACTGGTGGAGCAAA-3’，锚钉在插入序列的 5’ 末端；上游hBPI5 :5’ -CTTTGGTTCCTTTTAAAGGGAAG-3，，锚钉在载体上 XhoI 插入位点上游骨架序列匹配；下游hBPI6 :5’-TTTGTAGGGCTCTTAATTACTCA-3’，锚钉在载体上 XhoI 插入位点下游骨架序列匹配；将引物hBPIl/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，菌液 PCR 鉴定为阳性的克隆送基因测序，得到阳性的克隆pBCl-loxp-Neo-loxp-hBPI。本专利技术的有效果是本专利技术首次提出用构建乳腺特异表达hBPI载体制备动物乳腺生物反应器的手段来生产重组BPI蛋白，拟解BPI蛋白的表达量和生物活性等问题。乳腺特异表达hBPI载体是以PBCl为骨架载体，将XhoI处用体外合成的外源片段替代已插入基因；且该外源片段中hBPI的⑶S序列前添加了 Kozak序列和牛β -酪蛋白信号肽，实现动物乳腺内重组蛋白的表达量的提高与促使重组蛋白由胞质内向胞质外分泌；在如1:1处插有Loxp-Neo-Loxp序列，使得该载体可以在实现真核细胞的筛选，还可以通过Cre/loxp系统特异性重组在细胞水平和个体水平对两个Ioxp位点之间的筛选标记neo (Neomycin)序列去除,大大提高了转基因动物的安全性。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图I使用引物hBPIl/hBPI2菌液PCR鉴定电泳图。图2使用引物hBPI3/hBPI4菌液PCR鉴定电泳图。图3使用引物hBPI5/hBPI6菌液PCR鉴定电泳图。图4细胞上清液WB检测结果。 图5为LPS作为刺激物淋转后，读取酶标值后SPSS统计分析结果。图6为含BPI上清作为刺激物淋转后，读取酶标值后SPSS统计分析结果。图7为含BPI上清与LPS混合作为刺激物淋转后，读取酶标值后SPSS统计分析结果O[具体实施方式]一、乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白(下称hBPI)载体构建(I)根据人BPI基因序列(1464bp) (Genebank NM_001725. 2)，我们设计序列如下XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β -酪蛋白信号肽+人BPI的⑶S序列+XhoI酶切位点，由金斯瑞生物科技有限公司(Genscript)合成并克隆至pUC57载体的EcoR V酶切位点处，命为 pUC57-hBPI。(2)试剂盒提取 pUC57_hBPI、pBCl-loxp-neo-loxp-pBD 质粒,在 PCR 管中加入质粒、限制性内切酶Xho I、Buffer、H2O构成50 μ I的反应体系，37°C反应酶切4h。胶回收PBCl-PBD酶切后剩下的大片段，pUC57-hBPI酶切后的小片段。pBCl-loxp-neo-loxp-pBD酶切反应体系如表I所示表I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.乳腺特异表达人杀菌通透性增强蛋白载体构建方法，包括如下步骤 (1)设计合成如下序列XhoI酶切位点+Kozak序列+牛β-酪蛋白信号肽+人BPI的CDS序列+XhoI酶切位点，体外合成并克隆至pUC57载体的EcoRV酶切位点处，命名为pUC57-hBPI ； (2)使用限制性内切酶SalI分别酶切pUC57-hBPI、pBCl-loxp-neo-loxp-pBD;胶回收插入pUC57载体的体外合成的外源片段、pBCl-loxp-Neo-loxp片段；使用T4连接酶连接上述回收的片段； (3)上述连接产物转化至DH5ci感受态细胞中，涂布至氨苄抗性平板，挑单菌落摇菌；设计引物 hBPIl/hBPI2、hBPI3/hBPI4、hBPI5/hBPI6，使用菌液 PCR 法快速鉴定； 所述引物如下 上游 hBPIl :5’ -ACCATGAAGGTCCTCATC...

【专利技术属性】
技术研发人员：张运海，章孝荣，桂涛，李运生，刘亚，陈建文，章美玲，张宇，刘星，方富贵，丁建平，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：