本发明专利技术公开了一种牛乳腺特异性表达载体pBC-αs1及制备方法。本发明专利技术构建了一个可使目的基因在牛乳腺中特异性表达的载体pBC-αs1，通过在pcDNA3.1中插入pBC1中的绝缘子基因片段来防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成；通过在pcDNA3.1中插入牛α酪蛋白的调控基因片段来使目的基因在牛乳腺中特异性表达；通过构建两个酶切位点来控制目的基因的方向性，本发明专利技术实现了表达的高效性，并且通过Cre-LoxP重组酶系统可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞删除抗性标记基因，通过绝缘子防止其它基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
中的基因工程
，尤其是一种牛乳腺特异性表达载体pBC- a Si及制备方法。
技术介绍
动物乳腺组织特异性高效表达载体是研制乳腺反应器的重要生物元件，外源基因在动物乳腺中的高效表达必须依赖好的表达载体。酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，牛奶中存在着4种酪蛋白，分别为a SI酪蛋白、a S2酪蛋白、0酪蛋白和k酪蛋白，其中a SI酪蛋白在牛乳蛋白中含量最高，约为13g/L。牛酪蛋白基因座位存在座位控制区域(locus control region, LCR)，因而使得酪蛋白基因可以成为一个完全独立的表达单位。牛a SI-酪蛋白基因是制备乳腺生物反应器常用的表达载体，可以指导外源基因在动物乳腺中高水平表达。要在乳腺中表达外源基因，必需有一个高效的、乳腺特异性表达的启动区，显然，牛a SI酪蛋白基因的启动区是最好的候选启动区。牛a SI-酪蛋白基因全长17508bp，其中19个外显子占1138bp，大小在24 385bp ;18个内含子占16370bp，长度为90 1967bp。53bp的第I外显子为5'非翻译区，信号肽基因以及成熟蛋白质的前2个氨基酸由63bp的第2外显子编码。第18外显子和含有PolyA信号的第19外显子为3'非翻译区。除终止密码子UGA是由第17外显子的最后2个碱基UG和第18外显子的第I个碱基A经剪切后拼接而成外，其余三联体密码子均不受剪切影响，因此第3到第16外显子都是三碱基对的倍数。16个编码外显子中有9个均以“GAX”起始，这与cDNA序列分析结果一致。序列中主要的磷酸化位点是由第10外显子的第I个密码子(GAA)与前一外显子拼接后产生。牛a SI-酪蛋白基因的重要调控元件均位于启动区-400 -10。利用乳蛋白基因启动区进行乳腺特异性表达的转基因试验表明，只要乳蛋白基因启动区包括了 -500 +500的区域，一般就能够进行高水平的乳腺特异性表达。从牛a SI酪蛋白基因启动区来看它不具有CAAT盒，TATA盒序列“TTTAAAT”为一弱启动区，但牛aSl酪蛋白基因的表达量却很高，因此推测除了 5'端调控机制外，内含子及3'端在表达过程中会起到一定的作用。内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。将成熟的mRNA直接注射到核中，当它被运送到胞质中时并不能进行翻译，而在注射核酸结合蛋白的抗体或mRNA的3'端非编码区包含I个可剪接的内含子时，上述抑制被解除。有很多试验都表明采用基因组基因表达构件比采用cDNA表达构件提高表达量10 100倍。此外，异源内含子(特别是第1、2内含子)可提高外源基因(特别是以cDNA为表达构件)的表达效率。此外，内含子上的剪接信号也能刺激转录，因为RNA的加工与转录是一个互动的过程，剪接过程能反馈促进RNA聚合酶的活动。内含子除能促进转录外还可影响翻译。LoxP(locus of X_over Pl)序列来源于Pl曬菌体,是有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成，8bp的间隔序列同时也确定了 LoxP的方向。Cre在催化DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序列是Cre酶的结合域。Loxp位点与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，是条件性基因打靶、诱导性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。绝缘子是一种顺式作用元件。长约数百个核苷酸对，通常位于启动子正调控元件或负调控元件之间的一种调控序列，可防止其他基因或调控信号对目的基因的影响及异染色质的形成。目前所具有的乳腺特异性表达载体虽然已经不断开发出来，但并不丰富，表达效果各有偏重，通过检索，我们检索到公开号为CN 1873011A，名称为高表达水平的转基因动物乳腺特异性载体的构建方法，及申请号为200810105011. 0，名称为乳腺特异性表达载体及其构建方法，的相关专利技术专利，但以上专利技术专利的乳腺特异性表达载体与本专利技术的 乳腺特异性表达载体构成有着本质的不同，其表达效果也不相同。
技术实现思路
鉴于酪蛋白是哺乳动物包括母牛，羊和人奶中的主要蛋白质，目前所具有的乳腺特异性表达载体虽然已经不断开发出来，但并不丰富，表达效果各有偏重，本专利技术的目的在于针对现有技术的不足而提供一种能使目的基因在牛乳中特异性表达的载体pBC-a Si及其制备方法。本专利技术的技术实现方案如下一种牛乳腺特异性表达载体pBC-a Si，在质粒PCDNA3. I结构的Mun I与BamHI两酶切位点之间插入有质粒PBCl的Mun I与BamH I的酶切片段，称此时的载体为pcDNA3. I-In载体；在载体pcDNA3. I-In的BamH I与Pme I两酶切位点之间插入有合成好的牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl-5及牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl_3 ;载体pcDNA3. I-In的BamH I酶切端连接牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl_5 ;载体pcDNA3. I-In的Pme I酶切端连接牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl_3,其中asl_5另一末端携带Not I酶切位点，asl-3另一末端携带Xho I酶切位点，Not I和Xho I酶切位点作为目的基因插入位点。而且、所述牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2;所述牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。而且、所述载体在抗性标记基因两侧含有两个Loxp位点，可与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除。一种用于上述牛乳腺特异性表达载体pBC-a Si的制备方法，其制备步骤如下(I)通过Mun I和BamH I两种酶，将pBCl中包含绝缘子的一段长3658bp基因切下；(2)将步骤(I)的酶切产物回收片段插入Mun I和BamH I两种酶切后的pcDNA3. I载体中，称此时的载体为pcDNA3. I-In载体；(3)合成包含有启动子、外显子1、2以及内含子1、2的长为4919bp的牛a酪蛋白5'端序列，在合成的基因两端分别加入BamH I及Not I酶切位点，得到a sl_5 :(4)合成包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子的长为2339bp的牛a酪蛋白3'端序列，在合成的基因两端分别加入Xho I以及Pme I酶切位点，得到asl-3;(5)将合成好的a酪蛋白调控基因a sl-5, a sl-3插入到pcDNA3. I-In载体中，完成乳腺特异性表达载体pBC-a sl的构建。而且、所述步骤(I)至(5)中任一步都采用胶回收酶切产物。而且、所述步骤⑵或(5)都采用转化大肠杆菌DH5CI，提取质粒，酶切鉴定pcDNA3.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种牛乳腺特异性表达载体pBC-a si,其特征在于在质粒pcDNA3. I结构的Mun I与BamH I两酶切位点之间插入有质粒pBCl的Mun I与BamH I的酶切片段，称此时的载体为pcDNA3. I-In载体；在载体pcDNA3. I-In的BamHI与Pme I两酶切位点之间插入有合成好的牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl-5及牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl_3 ;载体pcDNA3. I-In的BamH I酶切端连接牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl_5 ;载体pcDNA3. I-In的Pme I酶切端连接牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl_3,其中asl_5另一末端携带Not I酶切位点，asl-3另一末端携带Xho I酶切位点，Not I和Xho I酶切位点作为目的基因插入位点。2.根据权利要求I所述的一种牛乳腺特异性表达载体pBC-aSi，其特征在于所述牛a酪蛋白的5'端部分调控序列asl-5中包含启动子、外显子1、2以及内含子1、2;所述牛a酪蛋白的3'端部分调控序列asl-3中包含外显子18、19，内含子17、18以及终止子。3.根据权利要求I或4所述的一种牛乳腺特异性表达载体pBC-aSi，其特征在于所述载体在抗性标记基因两侧含有两个Loxp位点，可与Cre重组酶构成Cre-LoxP重组酶系统，Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别Lox...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭宏，李光鹏，丁向彬，刘新峰，葛秀国，李吉霞，
申请(专利权)人：天津农学院，内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。