本发明专利技术涉及微生物学领域，具体涉及一种植物表达载体及高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生的制备方法。所述植物表达载体pCAMBIA1301-Gg1-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gG1基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别插入到载体pCAMBIA1301中而得到。本发明专利技术进一步提供了pCAMBIA1301-Gg1-LTB在制备高免疫原性单纯疱疹病毒gG1转基因花生中的应用。通过本发明专利技术方法提高了gG1和LTB基因在花生中的表达量；运用LTB基因，其基因产物具有粘膜免疫佐剂作用，机体服用后能提高单纯疱疹病毒gG1蛋白的免疫原性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学领域，具体涉及一种高免疫原性单纯疱疹病毒gGl转基因花生的制备方法。
技术介绍
转基因植物作为一种可行的表达系统，具有产物可修饰、安全、廉价、营养、易推广、可进行大规模生产等优点，是今后疫苗发展的方向。目前，已有多种病原微生物亚单位疫苗抗原在转基因植物中表达成功，而且在动物实验中获得了满意的结果。研究较多的受体植物是烟草和马铃薯。研究较多的亚单位疫苗抗原是乙型肝炎病毒表面抗原和人类免疫缺陷病毒包膜蛋白。在转基因植物疫苗研究中发现的主要问题是机体口服后易产生免疫耐受性。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)能与哺乳动物细胞表面神经节苷酯GM I结 合，具有粘膜佐剂活性。将LTB与单纯疱疹病毒gGl基因都作为目的基因一起转移到花生中表达，以发挥LTB的黏膜佐剂作用，减少了机体口服耐受性，提高了单纯疱疹病毒gGl转基因花生的免疫原性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是植物表达量低和机体口服后易产生免疫耐受性。本专利技术根据花生密码子的偏好性，修饰gGl和LTB基因序列，但不改变gGl和LTB氨基酸序列，在此基础上构建植物表达载体pCAMBIAl301-Ggl-LTB，使gGl和LTB在花生中闻表达。本专利技术公开了一种植物表达载体pCAMBIAl301-Ggl-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别通过EcoR I/BamH I, BamH I/Sph I, Sph I/Pst I, Pst I/Hind III 酶切位点插入到载体PCAMBIA1301中而得到；其中所述经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因序列如SEQ ID No. 12所示，所述经修饰的大肠杆菌LTB基因序列如SEQ ID No. I所示。本专利技术还公开了上述植物表达载体pCAMBIAl301-Ggl-LTB在制备高免疫原性单纯疱疹病毒gGl转基因花生中的应用。一种高免疫原性单纯疱疹病毒gGl转基因花生的制备方法，是用上述植物表达载体pCAMBIAl301-Ggl-LTB转化农杆菌，然后筛选获得阳性农杆菌用于转基因花生转化。本专利技术提高了 gGl和LTB基因在花生中的表达量；运用LTB基因，其基因产物具有粘膜免疫佐剂作用，机体服用后能提高单纯疱疹病毒gGl蛋白的免疫原性。附图说明图I.植物表达载体pCAMBIA1301_gGl的构建LB :左边界；RB :右边界；Hyg :潮霉素抗性基因；Pro :启动子；Ter :终止子；gus 3—半乳糖醛酸酶。图2.植物表达载体pCAMBIA1301-gGl-LTB的构建LB :左边界；RB :右边界；Hyg :潮霉素抗性基因；Pro :启动子；Ter :终止子；gus 3—半乳糖醛酸酶。图3. ELISA检测小鼠肠道洗液中的IgA图4. ELISA检测小鼠血清中的IgG具体实施例方式I.修饰gGl和LTB基因序列 按花生密码子偏好性修饰gGl和LTB基因序列，但不改变氨基酸的序列。修饰后的gGl基因序列如SEQ ID No. 12所示；gGl氨基酸序列没有改变，如SEQID No. 13 所示。修饰后的LTB基因序列如SEQ ID No. I所示。LTB氨基酸序列没有改变，如SEQ IDNo. 2所示。2.植物表达载体的构建(I)植物表达载体pCAMBIAl301-gGl的构建植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因、NOS终止子，以这些基因片段为模板，运用Oligo软件设计引物，见表I。按下列反应条件进行PCR扩增980C 5min ；98°C 10S,60°C 15S，72°C 60S，30 个循环；72°C延伸 IOmin0 回收的扩增产物与提取载体PCAMBIA1301 (购自上海希匹吉生物技术有限公司)DNA连接，得到植物表达载体pCAMBIA1301-gGl，见图 I。表I植物表达载体pCAMBIAl301-gGl所用引物序列引物名称引物序列酶切位点CaM￥35S Fl 5’ -CCGGAATTCCATGGAGTCAAAGATTCAMTAG-3’ ( SEQTDNo.3) 引入 EcoR I 酶切位点 Rl 5’ -TAGGATCCAGTCCCCCGTGTTCTCTCC-3’ ( SEQIDNo.4)引入 BamH I ft切位点gGlF2 5’ -GAGGATCCATGTTGGTTCTTGTCGGTGTATCG-3’ ( SEQID No.5)引入 BamH I 酶切位点 R2 5’ -AACTGCAGTCATGGTCTCGGGGCGCGC-3' ( SEQIDNo.6)引入 Pst 1_切位点l、u、F4 5’ -CGtXTGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCM-3' ( SEQIDNo. 10)引入 Pst I _切位点 R4 5’ -Cgcaagcttcccgatctagtaacatag-S' ( seqidno.ii) 引入 Him丨 in S每切位点(2)植物表达载体 pCAMBIAl301-gGl-LTB 的构建植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，以这些基因片段为模板，运用Oligo软件设计引物，见表2。按下列反应条件进行PCR扩增98°C 5min ；98°C I OS，60。。15S，72°C 60S，30个循环；72°C延伸IOmin0回收的扩增产物与提取载体pCAMBIA1301 (购自上海希匹吉生物技术有限公司)DNA连接，得到植物表达载体pCAMBIA1301-gGl-LTB，见图2。表2植物表达载体pCAMBIAl301-gGl-LTB所用引物序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种植物表达载体pCAMBIAl301-Ggl-LTB，是将植物组成型启动子CaMV35S基因、经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因、经修饰的大肠杆菌LTB基因、NOS终止子，分别通过EcoR I/BamH I, BamH I/Sph I，Sph I/Pst I, Pst I/ Hind III 酶切位点插入到载体pCAMBIA1301中而得到；其中所述经修饰的单纯疱疹病毒gGl基因序列如...
【专利技术属性】
技术研发人员：严华，纪剑峰，严慧深，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：
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