本发明专利技术涉及含有热休克蛋白HSP70C的用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0.7提呈的重组腺病毒表达载体,主要是对含CAG启动子/增强子及汉坦病毒76-118株的G2S0.7的嵌合基因的G2S0.7-pCAG转移载体进行改建，用于促进机体对高表达的汉坦病毒融合蛋白G2S0.7有效提呈。能有效提高实验动物机体的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及分子生物学、免疫学及免疫应用等相关领域。本专利技术涉及腺病毒重组转移载体的改建及其对肾综合征出血热(HFRS)致病原的ー种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG。
技术介绍
肾综合征出血热及其基因工程疫苗研究现状肾综合征出血热(hemorrhagicfever with renal syndrome, HFRS)是由汉坦病毒(Hantavirus，HV)引起，由鼠类等传播的ー种急性病毒性传染病，临床上以发热、出血和急性肾功能损害为主要特征。中国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物。为易感人群接种疫苗是预防传染性疾病大規模扩散最有效的防控措施。因此，针对HFRS疫苗的研究一直是该领域的热点。国内外近年来虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从部分人群试用的情况来看，该类疫苗还存在明显不足，主要是其诱导机体产生中和抗体的能力较弱，也不能有效地刺激细胞免疫应答。目前在HFRS基因工程疫苗基础研究中主要使用的是病毒囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，但GP免疫原性相对较弱，刺激机体产生的抗体出现较晚，滴度亦不高。本专利技术人多年对HV中免疫原性最強的核蛋白(NucleocapsidProtein, NP)的结构及功能，NP与GP不同片段嵌合基因(G1S0. 7、G2S0. 7)的构建及其表达，以及不同融合基因(蛋白)刺激机体免疫应答的能力及其影响因素等进行了较为深入的研究。一系列体内、外实验结果表明，上述嵌合基因在腺病毒表达系统中能有效地刺激机体的体液免疫(包括中和抗体)应答以及细胞免疫应答，且其效果均高于非嵌合组。 然而在研究中我们也发现了ー些问题，如尽管利用各种系统均能表达出完整的融合蛋白，但总的来说蛋白表达量还是偏低。此外，用融合蛋白免疫动物后虽然各表达系统均能刺激机体产生体液及细胞免疫应答，且腺病毒表达系统的效果要优于其他系统，但是整体的免疫水平还不十分理想。因此，进ー步选择合适的表达载体、优化表达系统对目前HFRS基因工程疫苗的研究有着重要的意义。本申请人前期对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pShuttle进行改建，将其CMV启动子替换为CAG启动子/增强子，得到含CAG启动子/增强子的汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7的重组腺病毒转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG，整合入腺病毒载体DNA中，得到重组腺病毒rAd-G2S0. 7-pCAG。通过比较表达融合蛋白G2S0. 7，结果显示该重组腺病毒与未替换启动子的原重组腺病毒rAd-G2S0. 7相比，能有效提高融合蛋白G2S0. 7的表达。在此基础上，本专利技术将HSP70抗原递呈分子基因C末端(HSP70 359_610aa)连接到该重组转移载体上，通过双酶切，进而将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，得到能够促进汉坦病韋融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病韋闻表达载体。优化腺病毒表达载体，促进机体对抗原的提呈促进疫苗组份在体内的有效提呈是提高HFRS基因工程疫苗的效率的途径之一。HSP70因其在抗原提呈和分子伴侶方面的突出优势引起了研究者的重视。热休克蛋白(heatshock protein, HSP)是ー组生物体内普遍存在、进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族，是生物在应激条件下产生的ー种非特异性、能增强机体对高低温、创伤、细菌和病毒感染等适应能力的防御性产物。HSP的主要生理功能是促进与維持新生多肽链的正确折叠，并且调节细胞的生长、分裂、分化、死亡。由于HSP參与蛋白质的转运、折叠和装配，所以HSP又被称为“分子伴侶”。根据分子量的大小和同源程度将HSP分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP等几个家族。HSP70家族广泛存在于各个亚细胞结构中。HSP70家族的结构分为3部分N端(44kDa)由4个α螺旋形成一个裂缝，比C端具有更高的保守性，它具有ATP酶活性，类似肌动蛋白ATP酶结构域；18kDa部分，由4个反向平行的β折叠和ー个α螺旋构成，是多肽的结合部位；C端(IOkDa)主要由α螺旋构成，是多肽和蛋白质·结合的部位，不同HSP70分子该部分的同源性较低。研究表明，HSP70家族蛋白基因与MHC分子基因类似，HSP70的蛋白结合基序与MHC-I类分子的构槽样结构非常相似，是ー种重要的分子伴侶，參与蛋白在细胞内的转运，可作为抗原提呈分子发挥作用。此外，HSP70本身也具有很强的免疫原性，可以作为一种佐剂，強烈地刺激机体免疫系统产生针对抗原的免疫反应，而不再需要其他的免疫佐剂。有研究认为HSP融合蛋白疫苗可能通过HSP的的分子伴侶作用将融合蛋白转移进入APC细胞内，进入MHC-I类分子递呈途径，从而将抗原表位递呈到APC表面，在HIV-lp24与HSP70的融合蛋白的研究中，HSP70能够增强HIV_lp24的免疫原性，激活机体的细胞和体液免疫反应，同时截短的HSP70完全可以替代HSP70独立行使其佐剂功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG，能有效提高融合蛋白G2S0. 7在实验动物体内的提呈效率，进而提高机体的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的G2S0. 7嵌合基因及CAG启动子/增强子的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端连接到该载体上，并整合入腺病毒载体DNA，以获得一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。本专利技术的技术方案是设计ー种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体G2S0. 7-pCAG，其制备方法是对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端HSP70 359_610aa连接到该载体上，命名为G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列为SEQ ID N0:1所示。本专利技术目的是通过以下方式实现的对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体pCAG-G2S0. 7进行改建，将HSP70抗原递呈分子基因C末端(HSP70359_610aa)连接到该载体上，得到改建的重组腺病毒转移载体，命名为G2S0. 7-pCAG-HSP70C，其全基因序列为SEQ ID NO: I所示。对重组转移载体和腺病毒载体双酶切，将G2S0. 7-pCAG-HSP70C整合入腺病毒载体DNA，得到重组腺病毒载体rAd-G2S0. 7-pCAG_HSP70C。本专利技术利用基因重组技术，将本申请人前期构建的含汉坦病毒76-118株的G2S0. 7的嵌合基因及CAG启动子/增强子的重组腺病毒转移载体PCAG-G2S0. 7进行改建，并将重组片段整合入腺病毒载体DNA中，以期获得一种用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7有效提呈的重组腺病毒高表达载体。将本专利技术rAd-G2S0. 7-pCAG-HS本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.含有热休克蛋白HSP70C的用于促进汉坦病毒融合蛋白G2S0. 7提呈的重组腺病毒表达载体，其制备方法是对含嵌合基因G2S0. 7的重组腺病毒转移载体G2S0. 7-pCAG...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐志凯，张芳琳，白文涛，李璞媛，程林峰，李凯，吴兴安，于澜，张亮，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：
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