本发明专利技术涉及一种长效稳定的胃泌酸调节素，它由人免疫球蛋白Ｇ的Ｆｃ片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。该融合蛋白的制备方法如下：分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白Ｆｃ片段基因，并将它们连接，然后构建含连接片段的重组表达载体；用重组表达载体转化宿主细胞，培养宿主细胞，然后从细胞培养物中回收和纯化得到重组融合蛋白。本发明专利技术的融合蛋白能用于制备治疗代谢疾病如糖尿病和肥胖症的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建一种长效稳定的胃泌酸调节素，及其用于治疗代谢疾病如糖尿 病和肥胖症的用途。
技术介绍
人体食欲和能量代谢调控主要由下丘脑、脑干孤束核、胰岛素、脂联素、瘦素 等胰岛、脂肪代谢信号分子、胃促生长激素、高血糖素样肽、胃泌素调节激素等胃肠激 素和迷走神经等来共同调节。下丘脑、延脑孤束核分泌的激素和神经递质及脂肪代谢信 号分子都需要通过神经系统和血液循环系统来发挥作用，针对这些调节通路的减肥药物 需要通过中枢神经来起作用，影响面大，副作用严重。只有胃肠激素多直接作用于胃肠 道，调节食欲和能量代谢。因此，针对胃肠激素的减肥药物靶点局限，副作用小。胃泌酸调节素(Oxyntomodulin，OXM)是肠上皮L-细胞分泌的一种短肽激素。 在人肠道末端有大量的OXM分布，在啮齿类动物胃肠道中，从十二指肠到回肠，OXM 的浓度逐渐增高，盲肠之后逐渐减少。肠上皮分泌胃泌酸调节素受营养和能量代谢调 节，进食后5-10分钟后OXM水平开始升高，30分钟后达到高峰。在体内有一定的昼夜 规律，清晨分泌水平低，晚上分泌水平高。OXM由37个氨基酸组成。对于OXM的认识来源于一些胃肠及腹部疾病患者血清中OXM的变化。人们发 现在一些胃肠道疾病如热带吸收不良，空肠回肠改道术等病态情况下，OXM水平显著变 化，其减轻体重的作用引起人们的注意。前期研究结果也显示，OXM是有效的减肥药 物，长期中枢性和周围性地给与OXM可减少大鼠的体重增加。静脉给与高于生理水平 的OXM可减少受试者食物摄取。Dhilfows等在为期四周的研究中发现，自行给与OXM 的超重或肥胖受试者，其摄入量显著少于生理盐水对照组，并且体重减轻也显著快于对 照组，这种效应在四周的研究过程中持续维持。OXM可减缓胃内营养物质的排空。具 有减少食物吸收，抑制食欲及动员脂肪、减少能量摄入，增加能量消耗，使能量代谢处 于负平衡状态，从而减轻体重的功能。啮齿动物脑室注射或皮下注射胃泌酸调节素可降低食物吸收和体重，减少脂 肪。英国研究人员在《糖尿病》杂志上报告，皮下注射OXM可有效地减轻体重和减少 脂肪组织。研究人员对26名过重或肥胖的志愿者进行了一项双盲研究。受试者被随机 指定在每餐前30分钟皮下注射OXM或盐水，同时要求他们在研究期间保持正常饮食和 常规水平的体育锻炼。治疗组体重减轻了 2.3kg，对照组0.5kg。治疗组显示瘦素水平降 低，脂联素增加，与脂肪组织减少一致。受试者的热量摄取也显著减少。开始研究进 餐时减少了 170kcal，最后进餐时250kcal。在嗜食性的感知上没有变化。OXM主要通 过三条途径调节食欲和能量摄取。一是直接作用于胃肠道胰高血糖素样肽-I(GLP-I)受 体，作用于迷走神经，调节食欲，抑制糖和脂肪的吸收。二是下调胃生长素的分泌，抑 制食欲。研究显示，皮下注射OXM可使啮齿动物血液中的胃生长素下降20%，而人类 可下降到44%。三是通过甲状腺途径刺激甲状腺素的合成分泌，增加能量消耗，动员脂肪分解。现在多认为OXM通过GLP-I受体起作用。在GLP-I受体敲除的小鼠实验中 发现，OXM的厌食效应消失。OXM具有很短的半衰期，可被细胞表面的二肽基肽酶IV (DP-IV)迅速失活， 然而，DP-IV抑制剂在临床中的体重效果居中，表明可能需要超生理水平的OXM来实现 人体的减肥。因此，胃泌酸调节素显示了作为代谢疾病如糖尿病和肥胖症的治疗手段的 潜力，但是，因为OXM的体内稳定性差，所以需要开发可被安全有效的给药用于治疗代 谢疾病如糖尿病和肥胖症的长效OXM。抗体的Fc结构域通常包含每个链的至少两个重链恒定区结构域，其二聚化形成 Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应功能，包括决定抗体半衰期和在体内的分布固定 补体和结合细胞表面Fc受体的能力。Fc结构域的性质使其称为有用的治疗剂。许多研 究已将Fc结构域融合于其他非抗体蛋白质，例如受体蛋白，例如伊纳西普，也可将Fc结 构域融合体用做研究试剂，Fc标签其有利于蛋白的检测与纯化。人IgG免疫球蛋白是体 内的主要抗体，它在人体内的半衰期约为20天，其稳定性是由于IgG的Fc片段可与新生 Fc受体(FcRn)结合，避免IgG进入溶酶体中被降解。因此，IgG的Fc片段被用来与活 性蛋白连接构成融合蛋白，以提高活性蛋白的体内半衰期，达到长效的目的。IgG可通过 Fc片段上的补体结合位点激活补体，起到细胞杀伤作用。根据铰链区的长短及Fc片段氨 基酸序列的不同，人IgG分为4个亚型，其中IgG Fc Y 2具有较低的诱导细胞毒性作用,而 IgG Fc Y 1最强。IgG融合蛋白的构建方式大多是将IgG的Fc (Hinge_CH2- CH3)片段或 CH(CH1-Hinge-CH2-CH3)片段的N端与活性蛋白的C端相连，以避免构建融合蛋白可 能对活性蛋白生物活性造成的影响。另外，如果活性蛋白以同源二聚体的形式发挥其生 物活性，Fc γ片段及铰链区的半光氨酸构成的分子间二硫键可增强和稳定融合蛋白二聚体 的形成。例如人白细胞功能抗原3 (LFA-3),肿瘤坏死因子受体II(TNFRII),白细胞介素 12(IL-12)等，这些融合蛋白在保留细胞因子生物功能的同时在动物实验中明显延长细胞 因子的半衰期。此外，IgG的融合蛋白可以通过Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。 因此尽管很多细胞因子与IgG的融合蛋白还处于研究的前期阶段，但是由于其高效性、半 衰期长及纯化方便的特点已经引起广泛的关注。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术通过构建OXM与人IgG Fc融合蛋白，增强了 OXM多肽的体内稳定性和延长了半衰期，并提供了该融合蛋白用于治疗代谢疾病如糖尿 病和肥胖症的方法。本专利技术的一个方面提供了一种重组胃泌酸调节素融合蛋白OXM-Fc，它由人免 疫球蛋白G的Fc片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。其中，OXM与Fc之间的链接肽选择至关重要，OXM通过连接肽来连接Fc与 OXM以形成融合蛋白，OXM连接肽-Fc或Fc-连接肽-OXM。连接肽可以是(G4S) 3_1(1， 连接肽长度优选是2-100个氨基酸，更优选是5-50个氨基酸，最优选为14-30个氨基 酸。连接肽长度可短至Fc对OXM形成的位阻保持最小，例如(G4S) i_2。连接肽有利 于OXM与其受体结合。所说的融合蛋白OXM-FC可以是包含SEQ ID NO:5所示氨基酸序列的多肽，或其片段同源物、类似物或衍生物。在一优选的实施方案中，OXM-Fc由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列组成。本专利技术的另一个方面提供了一种编码重组OXM-Fc融合蛋白的多核苷酸分子， 它是选自下列核苷酸序列的一种1)SEQ ID NO:6的核苷酸序列；2)与SEQID NO:6所示核苷酸序列至少70%相同的核苷酸序列；3)在严谨杂交条件下能与SEQID NO:6或其互补的多核苷酸分子杂交的核苷酸序列；4)编码与SEQID NO:5相同的氨基酸序列的蛋白质，但因遗传密码的简并性而在序 列上有所不同的核苷酸序列。本专利技术所说的融合蛋白OXM-Fc可通过以下方法制备(1)分别制得人胃泌酸调节素及免疫球蛋白G的Fc片段基因，(2)连接人胃泌酸调节素和本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人胃泌酸调节素融合蛋白，其特征在于，它由人免疫球蛋白Ｇ的Ｆｃ片段和人胃泌酸调节素通过一个连接肽构成的融合蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹鹏，夏志南，高健，蔡雪婷，卢悟广，
申请(专利权)人：曹鹏，夏志南，
类型：发明
国别省市：84
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