用于从脯氨酸生产五碳结构单元的方法和材料技术

本文件描述了通过在C5骨架底物(如D‑脯氨酸)中形成一个或两个末端官能团(包括羧基，胺或羟基)生产戊二酸，5‑氨基戊酸，5‑羟基戊酸，尸胺或1,5‑戊二醇的生物化学途径。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对相关申请的交叉引用本申请要求2013年8月27日提交的美国申请系列号61/870,438和2014年6月16日提交的美国申请系列号62/012,608的优先权。所述申请的公开通过提述以其整体并入。
本专利技术涉及使用一种或多种分离的酶，例如还原酶，消旋酶，激酶，脱氢酶，或ω-转氨酶，生物合成选自下组的一种或多种C5结构单元的方法：戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1,5-戊二醇，以及生产这些C5结构单元的重组宿主。专利技术背景尸胺(1,5-戊二胺)是一种C5二胺，其可以作为二胺单体与二酸一起使用以进行聚酰胺合成，如尼龙5,10或尼龙5,6。通常通过将赖氨酸脱羧到尸胺来生产尸胺。见例如Qian et al.,Biotechnol Bioeng.108(1):93-103(2011)。然而，赖氨酸的脱羧反应不是高效的过程，因为在此途径中以CO2失去了两个碳(二氨基庚二酸脱羧酶(C7)→赖氨酸脱羧酶(C6)→尸胺)。因此，清楚的是需要用于生产尸胺和其它可用于生产聚合物的C5单体的可持续且高效的方法。专利技术概述本文件至少部分地基于以下发现，即可能构建生物化学途径用于生产五碳链骨架前体，如D-脯氨酸，其中可以形成一个或两个官能团，即羧基，胺或羟基，从而导致以下一项或多项的合成：戊二酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸(也称为5-氨基戊酸(5-aminovalerate))，尸胺(也称为1,5-戊二胺)，以及1,5-戊二醇(此后统称为“C5结构单元(building block)”，并且每种化合物是“C5结构单元”)。可以生产戊二酸半醛(也称为5-氧代戊酸)作为其它产物的中间物。戊二酸和戊二酸盐(酯)，5-羟基戊酸和5-羟基戊酸盐(酯)，5-氧代戊酸和
5-氧代戊酸盐(酯)以及5-氨基戊酸和5-氨基戊酸盐(酯)在本文中可互换使用，指代以任何其中性或离子化形式的化合物，包括其任意的盐形式。本领域的技术人员应当理解具体的形式将依赖于pH。在一个方面，本文件的特征在于生产选自下组的C5结构单元的方法：戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1,5-戊二醇。所述方法包括在一个或多个酶促步骤中，酶促合成D-脯氨酸，并且将D-脯氨酸酶促转化为C5结构单元。可以从L-谷氨酸酶促合成D-脯氨酸(例如，使用以下外源酶的一个或多个，如一个，两个，三个或四个：谷氨酸5-激酶，谷氨酸半醛脱氢酶，吡咯啉5-羧酸还原酶，和脯氨酸消旋酶)。可以使用例如D-脯氨酸还原酶将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。可以使用例如(i)D-脯氨酸还原酶；(ii)5-氨基戊酸转氨酶；和(iii)选自下组的脱氢酶：戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用例如(i)D-脯氨酸还原酶；(ii)5-氨基戊酸转氨酶；和(iii)选自下组的脱氢酶：6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为5-羟基戊酸。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用羧酸还原酶，醇脱氢酶，和至少一种ω-转氨酶(例如，一种ω-转氨酶或两种不同的ω-转氨酶)将羟基戊酸转化为尸胺。至少一种ω-转氨酶可以归类于EC2.6.1.18,EC 2.6.1.19,EC 2.6.1.29,2.6.1.48,或EC 2.6.1.82。至少一种ω-转氨酶可以与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ IDNO:11,或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有70％或更高的序列同一性。羧酸还原酶可以与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:5,或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用例如羧酸还原酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸转化为1,5-戊二醇。羧酸还原酶可以与SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用醇脱氢酶和至少一种ω-转氨酶(例如，一种ω-转氨酶或两种不同的ω-转氨酶)将1,5-戊二醇酶促转化为尸胺。至少一种ω-转氨酶可以与SEQ
ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:11,或SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用例如羧酸还原酶和ω-转氨酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。ω-转氨酶可以与SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,或SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。可以使用D-脯氨酸还原酶，5-氨基戊酸转氨酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶，以及至少一种ω-转氨酶将D-脯氨酸酶促转化为尸胺。5-氨基戊酸转氨酶可以与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。羧酸还原酶可以与SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。在任意方法中，方法的全部或部分可以通过发酵在重组宿主中进行。宿主可以经历需氧，厌氧，或微需氧培养条件下的培养策略。可以在营养限制的条件下培养宿主。可以使用陶瓷中空纤维膜保留宿主以维持发酵期间的高细胞密度。进料至发酵的主要碳源可以衍生于生物原料。例如，生物原料可以是，或可以衍生于，单糖，二糖，木质纤维素，半纤维素，纤维素，木质素，乙酰丙酸，甲酸，甘油三酯，甘油，脂肪酸，农业废物，浓缩的酒糟可溶物，或城市废物。进料至发酵的主要碳源可以衍生于非生物原料。例如，所述非生物原料可以是，或可以衍生于：天然气、合成气、CO2/H2，甲醇，乙醇，来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。本文件的特征还在于重组宿主，其包括至少一种编码以下酶的外源性核酸：(i)D-脯氨酸还原酶，(ii)5-氨基戊酸转氨酶，和(iii)脱氢酶，所述宿主产生戊二酸或5-羟基戊酸。例如，宿主可以产生戊二酸且脱氢酶可以选自下组：戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶。例如，宿主可以产生5-羟基戊酸且脱氢酶可以选自下组：6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶。产生5-羟基戊酸的宿主进一步可以包括外源性羧酸还原酶和外源性醇脱氢，并进一步产生1,5-戊二醇。产生1,5-戊二醇的宿主进一步可以包括至少一种外源性ω-转氨酶和可选的第二和/或第三醇外源性脱氢酶，并进一步产生尸胺。产生5-羟基戊酸的宿主进一步可以包括外源性羧酸还原酶，外源性醇脱氢酶，以及至少一种外源性ω-转氨酶，并进一步产生尸胺。任意宿主
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【技术保护点】
一种生成选自由戊二酸，5‑氨基戊酸，尸胺，5‑羟基戊酸，和1,5‑戊二醇组成的组的C5结构单元的方法，所述方法包括在一个或多个酶促步骤中酶促合成D‑脯氨酸，并且将D‑脯氨酸酶促转化为所述C5结构单元。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.27 US 61/870,438;2014.06.16 US 62/012,6081.一种生成选自由戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，和1,5-戊二醇组成的组的C5结构单元的方法，所述方法包括在一个或多个酶促步骤中酶促合成D-脯氨酸，并且将D-脯氨酸酶促转化为所述C5结构单元。2.权利要求1的方法，其中从L-谷氨酸酶促合成D-脯氨酸。3.权利要求1或2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。4.权利要求3的方法，其中使用D-脯氨酸还原酶将D-脯氨酸酶促转化为5-氨基戊酸。5.权利要求1或权利要求2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。6.权利要求5的方法，其中使用(i)D-脯氨酸还原酶；(ii)5-氨基戊酸转氨酶；和(iii)选自由戊二酸半醛脱氢酶，琥珀酸半醛脱氢酶，醛脱氢酶，5-氧代戊酸脱氢酶，6-氧代己酸脱氢酶，和7-氧代庚酸脱氢酶组成的组的脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为戊二酸。7.权利要求1或权利要求2的方法，其中将D-脯氨酸酶促转化为5-羟基戊酸。8.权利要求7的方法，其中使用(i)D-脯氨酸还原酶；(ii)5-氨基戊酸转氨酶；和(iii)选自由6-羟基己酸脱氢酶，5-羟基戊酸脱氢酶，和4-羟基丁酸脱氢酶组成的组的脱氢酶将D-脯氨酸酶促转化为5-羟基戊酸。9.权利要求6或权利要求8的方法，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。10.权利要求7-9中任一项的方法，其中使用羧酸还原酶，醇脱氢酶，和ω-转氨酶将5-羟基戊酸转化为尸胺。11.权利要求10的方法，其中所述ω-转氨酶归类于EC 2.6.1.18，EC2.6.1.19，EC 2.6.1.29，EC 2.6.1.48，或EC 2.6.1.82下。12.权利要求7-9中任一项的方法，其中将5-羟基戊酸转化为1,5-戊二醇。13.权利要求12的方法，其中使用羧酸还原酶和醇脱氢酶将5-羟基戊酸转化为1,5-戊二醇。14.权利要求10或权利要求13的方法，其中所述羧酸还原酶与SEQ IDNO:1，SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:5，或SEQ ID NO:6中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。15.权利要求12-14中任一项的方法，其中使用醇脱氢酶和ω-转氨酶将1,5-戊二醇酶促转化为尸胺。16.权利要求10，11或15的方法，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，SEQ ID NO:10，SEQ ID NO:11，或SEQ IDNO:12中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。17.权利要求3或权利要求4的方法，其中将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。18.权利要求17的方法，其中使用羧酸还原酶和ω-转氨酶将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺。19.权利要求18的方法，其中所述ω-转氨酶与SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9，或SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。20.权利要求1或权利要求2的方法，其中使用D-脯氨酸还原酶，5-氨基戊酸转氨酶，醇脱氢酶，羧酸还原酶，和ω-转氨酶将D-脯氨酸酶促转化为尸胺。21.权利要求20的方法，其中所述5-氨基戊酸转氨酶与SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。22.权利要求20或权利要求21的方法，其中所述羧酸还原酶与SEQ IDNO:6中列出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性。23.前述权利要求中任一项的方法，其中完全或部分通过发酵在重组宿主中进行所述方法。24.权利要求23的方法，其中所述宿主经历需氧、厌氧、或微需氧培养条件下的培养策略。25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述宿主在营养限制的条件下培养。26.根据权利要求23-25中任一项的方法，其中使用陶瓷中空纤维膜保留所述宿主来维持发酵期间的高细胞密度。27.权利要求23-26中任一项的方法，其中进料至发酵的主要碳源衍生于生物原料。28.权利要求27的方法，其中所述生物原料是以下物质，或衍生于以下物质：单糖、二糖、木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸、甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩的酒糟可溶物，或城市废
\t物。29.权利要求23-26中任一项的方法，其中进料至发酵的主要碳源衍生于非生物原料。30.权利要求29的方法，其中所述非生物原料是以下物质，或衍生于以下物质：天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸、来自环己烷氧化过程的非挥发性残留物(NVR)碱洗废物流，或对苯二甲酸/间苯二甲酸混合物废物流。3...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH