烟草C2H2型锌指蛋白基因Nt540的应用制造技术

本发明专利技术公开了烟草C2H2型锌指蛋白基因Nt540的应用。本发明专利技术提供了一种基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还公开了包含前述基因片段的重组载体、重组菌以及它们的用途。本发明专利技术通过转入Nt540基因以及重组菌，有效提升了烟草的品质，为烟草品种改良提供了新材料和新途径，具有较强的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
烟草C2H2型锌指蛋白基因Nt540的应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及烟草C2H2型锌指蛋白基因Nt540的应用。
技术介绍
烟草是一种以吸食为主要目的特殊经济作物,香气足是优质烟叶必备具备品质之一，具体表现为充足纯正、劲头适中、吃味醇和、余味舒适、吸食安全性高等。影响烟叶香气因素很多，研究显示，烟叶表皮毛能分泌精油、树脂、蜡质等成分，这些物质对烟草的抗虫性有重要作用，同时与烟草的香气和吃味密切相关。据报道，存于烟草叶片和烟气中的化学成分共计5289种。在众多组分中,影响烟草的品质主要是那些形成香味和吃味的物质,如含氮化合物、碳水化合物、烟草生物碱等。一般来说,一定范围内糖含量高的烟叶品质好。氨基酸则与烟叶的香味、吃味关系密切，是形成烟叶香气物质的前体。所以，烟叶中的化学成分种类和数量直接影响到烟叶的内在质量、决定烟叶的香气、品质。相对于在抗病毒、抗旱、抗虫转基因烟草品种培育的方面较的投入和成果，基因工程技术在改善烟草品质方面的应用研究较少，目前主要集中在针对某一类具体物质如萜类、胡萝卜素类或钾离子等物质的含量进行调控，而协调烟草碳氮比、降低烟碱等方面研究较少，特别是在整体水平上调控烟叶组成，从而提高相关品质的研究较少。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种新的基因，并通过将其转基因的方式来提高植物组织培养分化效率。本专利技术首先提供了一种基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供了一种重组载体，它包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选地，所述重组载体是重组pBI121载体。本专利技术还提供了一种重组菌，它包含前述重组载体.优选地，所述重组菌为重组农杆菌，进一步优选为重组农杆菌EHA105。本专利技术还提供了一种蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示.本专利技术还提供了前述的基因片段、重组载体、重组菌、蛋白在提高植物的叶片表皮毛数量、游离氨基酸含量、还原糖含量和/或总糖含量中的用途。其中，所述植物为烟草。本专利技术还提供了一种提高植物的叶片表皮毛数量、游离氨基酸含量、还原糖含量和/或总糖含量的方法，取前述的基因片段、重组载体、重组菌，转入植物中，即可。其中，所述植物为烟草。本专利技术发现将Nt540基因转入烟草植株过表达后，可显著改变烟叶品质相关成分的含量。除烟碱外，过表达该基因的烟草植物的叶片表皮毛数量、游离氨基酸含量、总糖和还原糖的含量都显著提高，说明该基因的导入能够增加叶片表皮毛数量、改变烟叶的化学组成，从而进一步改变烟叶的品质。单基因导入使得多种成分发生变化，在烟叶中并不多见。本专利技术制备得到了Nt540基因以及重组菌，将其转入植物中，可以有效提升烟草的品质，本专利技术为烟草品种改良提供了新材料和新途径，具有较强的应用前景，经济效益良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1.Nt540基因PCR产物电泳检测结果，其中M为分子量标准；1为空白对照，2和3为Nt540片段；图2.为烟草抗性植株再生情况。其中，A为抗性芽分化情况；B为抗性植株生长；C为抗性植株生根情况；图3.稳定表达植株中Nt540基因表达的实时定量PCR分析.其中A为野生型，B为超表达Nt540型。具体实施方式生物材料：烟草(Nicotianatabacco)、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌株DH5α、根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105、载体pBI121、载体pCAMBIA1301由生物资源与生态环境教育部重点实验室(四川大学)保存。所用试剂均为市售的进口或国产分析纯试剂。实施例1本专利技术烟草Nt540基因的制备及其应用(1)基因片段和载体的构建提取烟草总RNA，并取少量RNA用于琼脂糖凝胶电泳，叶片总RNA电泳结果表明，总RNA的28SrRNA与18SrRNA之间的亮度比约为2:1，无明显拖尾，也看不见明显的DNA和蛋白质污染，说明RNA提取的结果较好，降解少，分子完整，表明所提mRNA纯度高，可用于反转录，获得cDNA进行后续试验。利用含有XbaI和XmaI酶切位点的特异性引物(F:gctctagaatggagaaaacagacagagaaact；R：tcacaagtgtagatctaaactcacatg)，以烟草cDNA为模板进行PCR扩增目的基因的开放阅读框(ORF)。其PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，分子量约为700bp左右，与预计片段大小相符合(附图1)。将PCR产物胶回收后连接T载体转入DH5α感受态，获得阳性克隆进行测序。测序结果显示目的基因Nt540的核苷酸序列为：前述核苷酸序列所述的NtZFP8基因可以通过采用上述方法获得，也可以直接合成。将测序正确的大肠杆菌质粒和pBI121质粒经过限制性内切酶XbaI和XmaI双酶切，回收目的条带。用T4连接酶连接目的条带，16℃连接过夜获得重组子后，将重组子转入大肠杆菌感受态细胞获得转化子。以转化子质粒为模板，用目的基因特异性引物对其进行扩增获得一条大小一致的目的片段，初步表明转化子中含有目的序列。随后用限制酶XbaI和XmaI进行双酶切，电泳检测获得一条大片段和目的条带大小的小片段。证明pBI121载体已与目的基因Nt540相连，表达载体构建成功。提取转化子的质粒，将其转化农杆菌EHA105感受态后，为鉴定转化是否成功，挑取单菌落进行菌落PCR。菌落PCR结果显示出现了与目的基因Nt540的大小一致的目的带，对条带进行测序，与Nt540序列相一致，表明构建正确。(2)转基因植物的制备及其性质检测先将烟草叶盘预培养2-3天，然后用含有植物表达载体的根癌农杆菌分别进行侵染。共培养3-4天后，将叶盘取出，用无菌水洗菌，然后再转到筛选培养基进行筛选及分化培养，约3周左右开始分化出抗性芽。待抗性芽长至3-4cm高时，将其从外植体基部切下，接种到生根培养基上进行生根培养。待小植株根系发达后，进行驯化移栽(图2)。得到大量移栽成活的抗性植株。将PCR检测呈阳性的植株移栽到大花盆中，直到收获种子，多次种植，直到获得Nt540稳定遗传的转基因植株。同时，对获得的稳定转基因植株进行荧光定量PCR验证，结果表明其Nt540基因表达量明显高于野生型对照，说明基因过表达成功(附图3)，证明本专利技术构建得到了含有Nt540基因的转基因烟草。目的基因Nt540表达的蛋白质的氨基酸序列为：MEKTDRETRDFMNVESFSQLPFIRPAPAKEKAIRLFGKEFGTAGDSMAATDESESIETNPSQEEIKDHISNNSESSRKFECHYCCRNFPTSQALGGHQNAHKRERQHAKRAHLQSAMVHGALTEANIYGIMNYHRLGSAPTAAYHHHYTTNNINNATRFYGSQHHVNSTVTTPYNSHQTPINGSPLALWRIPAATNVHHTSSSSPNFGRERSMNMQPLPVFAANNEDFK本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基因片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组载体，其特征在于：它包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是重组pBI121载体。4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求3或4所述的重组载体。5.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组农杆菌，优选为重组农杆菌EHA105。6.一种蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐莺，时小东，任学良，赵杰宏，王灵慧，田银帅，邹颉，
申请(专利权)人：贵州省烟草科学研究院，四川大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52