本发明专利技术涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于检测芳香烃受体配体(例如二恶英类物质)的人源化重组载体以及重组细胞。本发明专利技术还涉及所述重组载体和细胞在芳香烃受体配体(例如二恶英类物质)生物检测方面的用途。本发明专利技术将包含DRE序列的人类CYP1A1基因的启动子或启动子的部分区段克隆到带有荧光素酶报告基因的基础载体上，所获得的重组载体和细胞对二恶英有良好的响应，最低检测限可达到0.3pM，特别适合用于评估芳香烃受体配体(例如二恶英类物质)对人体健康的影响及其相关机理研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组载体和重组细胞，具体涉及一种用于检测芳香烃受体(AhR，也叫二恶英受体)的配体(例如二恶英类物质)的人源化重组载体以及包含该重组载体的重组细胞。本专利技术还涉及所述重组载体和细胞用于检测芳香烃受体的配体(例如二恶英类物质)的用途。
技术介绍
二恶英类污染物(Dioxins)包括多氯二苯并二恶英(PCDDs)、多氯二苯并呋喃(PCDFs)和多氯联苯(PCBs)等，是一类典型的持久性有机污染物，对人体具有广泛的毒性效应。由于其具有环境持久性、可以远距离迁移、难降解及生物累积性，将对人类健康构成长期的威胁。历史上二恶英的人体暴露事件已屡见不鲜。例如1949年，美国孟山都化工厂的一次混有二恶英类物质的化学品泄露导致当地居民患上氯痤疮、肝脏疾病、癌症等，并导致了部分居民的死亡；2004年，乌克兰总统尤先科在二恶英中毒后患上了严重的氯痤疮等一系列疾病。二恶英的人体暴露事件以及其带来的严重健康危害引起了人们对二恶英健康效应的广泛关注和深入研究。研究表明，二恶英类物质能够干扰神经系统功能及发育、阻碍生殖、引发肝脏毒性、促进肿瘤的生成、造成严重的皮肤病变等等。正是由于人们对二恶英类污染物的持续高度关注，目前对这类污染物的毒理机制的研究是持久性有机污染物中最完善和最深入的。研究表明，二恶英受体(AhR，芳香烃受体)介导的信号转导机制是二恶英类污染物造成毒性效应的主要分子机制。二恶英类污染物在进入细胞后与胞质内的AhR结合，并活化AhR，随后二恶英-AhR复合物转移入核，在细胞核中聚集并与AhR转运蛋白结合形成异源二聚体，进而与基因
上游的特异性增强子即二恶英反应原件(Dioxins responsive element,DRE)结合，激活效应基因的转录，其中最经典的效应基因包括CYP家族成员，如CYP1A1等。二恶英类物质的生物检测系统正是基于上述生物过程而构建的。其中基于报告基因的二恶英类生物检测系统具有检测周期短、成本低、高灵敏度的特征，并在评价二恶英类污染物总体毒性方面有突出的优势，适用于二恶英类污染物的健康风险评估。随着对AhR信号通路的研究的深入，越来越多的证据表明该受体可能具有重要的生物学功能，包括维持免疫调节系统的平衡，调节肠道固有免疫功能，参与心血管及神经系统发育等等。同时也提出一系列内源性配体可以激活AhR并引发下游信号通路机制从而引起一系列功能基因表达的改变，例如色氨酸的光解产物6-甲酰基吲哚并[3,2-B]咔唑(FICZ)，其激活AhR的能力与最强的二恶英类污染物2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(TCDD)相当。另外，研究人员也发现一系列的药物及中间体，天然产物及生物代谢物也可以作用于AhR，激活或抑制其下游的信号通路及基因表达，从而引起一系列分子及细胞效应。随着前述基于AhR的生物检测系统的建立和完善，不断有更多的作用于AhR的化合物被发现，这些化合物可能成为一些药物研发的备选化合物。目前已有的生物检测系统大多基于小鼠CYP1A1基因的增强子所构建，虽然对二恶英类污染物具有良好的响应，但是并不能真实反映出二恶英类物质对人体的影响。原因在于AhR信号通路具有显著的种属差异性，例如一些多氯联苯类物质能够与2,3,7,8-四氯二苯并二恶英(TCDD)竞争结合小鼠AhR，但不会竞争结合人类AhR，说明鼠源和人源的AhR与二恶英类化合物的结合方式存在差异；另外也有证据表明鼠源和人源的AhR配体结合结构域的序列不同。因此，无论是环境监测、公共卫生，还是活性物质的发现及新药研发都迫切需要人源化的芳香烃受体配体(例如二恶英类物质)的生物检测系统。
技术实现思路
本专利技术的专利技术人通过反复实验和大量创造性劳动，提供了基于人的CYP1A1基因启动子的生物检测系统，其灵敏度高，对芳香烃受体的配体化合物(例如二恶英类化合物)有良好的响应，由此完成了本专利技术。本专利技术第一方面涉及重组载体，所述重组载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段，以及报告基因；所述人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段调节所述报告基因的转录。在本专利技术的一些实施方案中，其中所述人的CYP1A1启动子的序列包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-3534～-2448所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：3所示的序列。在本专利技术中，所述-3534～-2448所示的序列的变体是指由于不同人群所产生的CYP1A1启动子的不同序列，其在序列长短和具体序列上可能有微小的差异，例如可以包括个别碱基的插入、缺失或替换等，但只要其具有与本专利技术的人的CYP1A1启动子相同的功能，即包括在本专利技术的范围内。在本专利技术的一些实施方案中，其中所述人的CYP1A1启动子的部分区段包括该启动子的基本区段和两个或多个(例如3、4、5、6、7、8个)相同或不同的二恶英反应元件(DRE)富集区段，并且所述的两个或多个DRE富集区段位于所述启动子的基本区段的上游。在本专利技术的具体实施方案中，人的CYP1A1启动子的基本区段和两个相同的二恶英反应元件富集区段之间可操作地连接。在本专利技术中，所述启动子的基本区段为能够启动下游基因转录表达的启动子核心区段。在本专利技术的一些实施方案中，其中所述的基本区段包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-2706～-2448所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：10所示的序列。在本专利技术中，所述-2706～-2448所示序列的变体是指由于不同人群所产生的CYP1A1启动子基本区段的不同序列，或者由于在区段的划分
标准上略有不同而产生的基本区段的不同序列，该变体在序列长短和具体序列上可能有微小的差异，例如在该序列5’端和3’端的选择上可能略有不同，或者可以包括个别碱基的插入、缺失或替换等，但只要其具有与本专利技术的人的CYP1A1启动子基本区段相同的功能，即包括在本专利技术的范围内。在本专利技术中，所述二恶英反应元件(DRE)富集区段是指含有两个或两个以上DRE且DRE位置相对比较接近的序列区段。在本专利技术的一些实施方案中，所述二恶英反应元件(DRE)富集区段含有人的CYP1A1启动子5’端的3个DRE序列。在本专利技术中，所述二恶英反应元件(DRE)选自GCGTG和CACGC。在本专利技术的一些实施方案中，其中所述的二恶英反应元件(DRE)富集区段是指包含人的CYP1A1启动子5’端的3个DRE序列的相应区段，例如包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-3534～-3217所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：11所示的序列。在本专利技术中，所述-3534～-3217所示序列的变体是指由于不同人群所产生的含有三个DRE的富集区段的不同序列，或者由于在区段的划分标准上略有不同而产生的富集区段的不同序列，该变体在序列长短和具体序列上可能有微小的差异，例如在该序列5’端和3’端的选择上可能略有不同，或者可以包括个别碱基的插入、缺失或替换等，但只要其具有与本专利技术的DRE富集区段相同的功能，即包括在本专利技术的范围内。在本专利技术中，所述人的CYP1A1启动子的基本区段和两个或多个二恶英反应元件富集区段之间的连接方式、或两个或多个二恶英反应元件富集区段之间的连接方式为本本文档来自技高网...
【技术保护点】
重组载体，所述重组载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段，以及报告基因；所述人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段调节所述报告基因的转录。
【技术特征摘要】
2015.05.21 CN 201510260018X1.重组载体，所述重组载体沿着其基因转录的方向可操作地连接有来源于人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段，以及报告基因；所述人的CYP1A1启动子或该启动子的部分区段调节所述报告基因的转录。2.权利要求1的重组载体，其中所述人的CYP1A1启动子的序列包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-3534～-2448所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：3所示的序列。3.权利要求1的重组载体，其中所述人的CYP1A1启动子的部分区段包括该启动子的基本区段和两个或多个相同或不同的二恶英反应元件(DRE)富集区段，并且所述的两个或多个二恶英反应元件(DRE)富集区段位于所述启动子的基本区段的上游。4.权利要求3的重组载体，其中所述的基本区段包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-2706～-2448所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：10所示的序列。5.权利要求3的重组载体，其中所述的二恶英反应元件(DRE)富集区段是指包含人的CYP1A1启动子5’端的3个DRE序列的相应区段，例如包含人的CYP1A1基因转录起始位点上游的-3534～-3217所示的序列或该序列的变体，例如包含SEQ ID NO：11所示的序列。6.权利要求1的重组载体，其中所述的报告基因选自荧光素酶(例如为萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶)基因、荧光蛋白(例如绿色、黄色、青色、红色荧光蛋白)基因或其它报告基因。7.权利要求1-6任一项的重组载体，所述重组载体的基础载体选自适用于真核细胞表达的含有报告基因的载体，例如pGL、pECFP、pEmcherry、pEGFP、pEmvenus、pEYFP等系列载体，优选地，其中所述的pGL系列载体选自pGL2、pGL3、pGL4和pGL6。8.权利要求7的重组载体，其为重组载体pCL-HFL或pCL-HCR2。9.重组细胞，其含有权利要求1-8任一项的重组载体。10.权利要求9的重组细胞，其中所述细胞为来源于人的细胞，例如为来源于人的肝源、肺源、肾源、神经源或上皮源细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵斌，尹雪娇，李帅章，谢群慧，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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