鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种鸽圆环病毒样颗粒、其制备方法与应用。本发明专利技术将鸽圆环病毒ORF C1基因与昆虫细胞表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统获得鸽圆环病毒样颗粒。将所述鸽圆环病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到鸽圆环疫苗。本发明专利技术的鸽圆环病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本发明专利技术的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及一种。本专利技术将鸽圆环病毒ORF C1基因与昆虫细胞表达载体连接，利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统获得鸽圆环病毒样颗粒。将所述鸽圆环病毒样颗粒与防腐剂和佐剂混合，即制备得到鸽圆环疫苗。本专利技术的鸽圆环病毒样颗粒及其疫苗能高效诱导机体产生抗体，填补了国内此类疫苗的空白。本专利技术的制备方法适于工业化生产，具有成本低、安全性高等优点。【专利说明】
本专利技术涉及一种，属于免疫学及基因工程

技术介绍
鸽圆环病毒(PiCV)由Woods等（1993)首次在美国加利福尼亚发现，患病鸽多为2-12月龄青年鸽，主要表现食欲下降、精神萎靡、羽毛凌乱、呕吐腹泻、多尿、嗉囊充满液体等 临床症状。组织学表现为淋巴器官(法氏囊和胸腺)萎缩，骨髓再生不良。从1994年开始，澳 大利亚和许多欧洲国家包括北爱尔兰、英格兰、德国、法兰西、比利时、意大利等陆续报道发 现鸽圆环病毒。Raue等(2005)通过试验发现青年鸽疾病综合症(YTOS)与鸽圆环病毒的感染 密切相关。Duchatel等(2006)对鸽圆环病毒的传播途径进行了研究，发现鸽圆环通过接触 和垂直传播。 鹤圆环病毒属于圆环病毒科(Circoviridae)，1995年国际病毒分类委员会(ICTV) 第六次病毒分类报告上新增的一个病毒科。鸽圆环病毒呈球形，二十面体对称，无囊膜，直 径为15-18nm，其基因组为单链环状DNA，大小约为2.0此。基因组编码5个01^，其中01^￥1编 码Rep复制相关蛋白，0RFC1编码Cap外壳蛋白，其余3个0RF编码功能未知的蛋白质。到目前 为止，圆环病毒科除PCV可以在PK-15等细胞中繁殖以外，其余圆环病毒均尚未能培养成功， 因此圆环病毒特别是禽类的圆环病毒研究受到了一定的限制。 鸽圆环病毒在我国广泛流行，并对鸽子的养殖业造成巨大损失。余旭平等（2007) 从中国浙江地区的病鸽体内检测到鸽圆环病毒的广泛存在。余旭平等(2009)设计引物对鸽 圆环病毒浙江株进行了全基因组的克隆并进行了序列分析，发现10个欧美株组成一个大的 分支，而浙江株与澳洲株各自独立分支。 鸽圆环病毒无法在细胞系培养，因此尚无鸽圆环疫苗研究的报道，亟待探索鸽圆 环疫苗的制备方法，应对日趋严峻的鸽圆环疫情，提高鸽业养殖效益。 近年来，病毒样颗粒作为疫苗抗原逐渐受到重视，特别是适用于无细胞系培养的 病毒。病毒样颗粒是由病毒的结构蛋白自主包装形成，与天然病毒的形态一致，且能够诱导 机体产生细胞免疫和体液免疫。病毒样颗粒不包裹核酸，不能复制，因此也没有感染性，是 一种安全的抗原。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种，该 方法利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统制备鸽圆环病毒样颗粒。 本专利技术的另一目的是提供鸽圆环病毒样颗粒及其应用。 本专利技术的技术方案如下： -种鸽圆环病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤： (1)将核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示的鸽圆环病毒ORF C1基因插入到昆虫细胞 表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DHlOBac感受态细胞，提取阳性质 粒，制得整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒Bacmid质粒； (2)将步骤（1)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了鸽 圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒； ⑶将步骤⑵制得的整合了鸽圆环病毒〇RF C1基因的重组杆状病毒接种昆虫细 胞，培养后收获，经纯化制得鸽圆环病毒样颗粒。 根据本专利技术优选的，所述步骤（1)中，昆虫细胞表达载体选自：AcRP23_lacZ、 AcRP6_SC、AcUWl_lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、 pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAc(^4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、 pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、 pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、 pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、 pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSH0NEX 1.1、 pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、 pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC_5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT B、pFastBacHT C、pFastBacDual之一或两种以上的混合;进一步优选的，所述步骤（1)中，昆 虫细胞表达载体为pFastBacl。 根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中，重组杆状病毒为重组苜蓿银纹夜蛾核型多角 体病毒rAcMNPV。根据本专利技术优选的，所述步骤（2)中，昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21细胞系、昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf9细胞系、 昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Mimic Sf9细胞系、甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua)Se 301 细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl细胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLG4 细胞系、粉纹夜蛾（Trichoplusia ni)BTI-Tn-5Bl-4细胞系、BTI-Tn-5C1 细胞系、Bn-Tn-5F2细胞系，斜纹贪夜蛾(Spodoptera litura)ZSU-Sl-l细胞系、IBL-SL1A细胞系、家蚕卵巢 细胞系BmN之一；进一步优选的，昆虫细胞选自昆虫细胞选自草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda)Sf21 细胞系。 根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中，纯化为采用蔗糖密度梯度离心进行纯化，蔗 糖质量体积浓度为10 %、30 %和50 %，单位g/mL; 进一步优选的，所述步骤(3)中，纯化步骤如下： 将培养产物经5000rpm离心20min，收集细胞，然后经25mM NaHC03溶液裂解10min， 再经1 X 104rpm离心10min，取沉淀溶解于PBS溶液，加到梯度鹿糖上层液面上，3.5X 104rpm 离心2h，收集在质量体积浓度为10 %~30 %蔗糖液面之间的白带，去除蔗糖，制得鸽圆环病 毒样颗粒。 经检测，鸽圆环病毒样颗粒主要有效成分为Cap蛋白。 -种鸽圆环病毒样颗粒，包括鸽圆环病毒Cap蛋白；所述的鸽圆环病毒Cap蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。 上述鸽圆环病毒样颗粒在制备鸽圆环疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸽圆环病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的鸽圆环病毒ORF C1基因插入到昆虫细胞表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，制得整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；(2)将步骤(1)制得的重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒；(3)将步骤(2)制得的整合了鸽圆环病毒ORF C1基因的重组杆状病毒接种昆虫细胞，培养后收获，经纯化制得鸽圆环病毒样颗粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑学星，盖微微，于学杰，郑文文，宋艳艳，赵丽，温红玲，雷晓颖，王志玉，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37