一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种重组脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，并进一步公开其制备方法，以及其在制备疫苗药物领域的应用。本发明专利技术所述制备重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的方法，在昆虫表达系统中成功的制备了脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，且所述脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒可有效用于制备基于病毒样颗粒的脊髓灰质炎疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒及其制备方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种重组脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，并进一步公开其制备方法，以及其在制备疫苗药物领域的应用。
技术介绍
脊髓灰质炎(Poliomyelitis)是一种由脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)所致的急性传染病，会严重危害儿童的身体健康。脊髓灰质炎病毒侵袭人的神经系统，可在数小时内造成机体完全瘫痪；脊髓灰质炎病毒还可以通过口腔进入体内并在肠道内繁殖，引起的初期症状可表现为发热、乏力、头痛、呕吐、脖颈僵硬以及四肢疼痛。未免疫人群中几乎所有人均可能感染脊髓灰质炎，感染者中有少数人会出现麻痹症状，由于该症状好发于婴幼儿，故又俗称小儿麻痹症。每200例感染病例就有一例导致不可逆转的瘫痪(通常是两腿瘫痪)，在瘫痪病例中，约有5-10％的患者会因呼吸肌麻痹而死亡。脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒(Picornaviridae)的肠道病毒属(Enterovirus)。脊髓灰质炎病毒结构为正二十面体结构，直径约为27-30nm，无包膜结构。脊髓灰质炎病毒的基因组为单股正链RNA，由5’非编码区、P1区、P2区、P3区和3’非编码区组成。其中，P1编码病毒的结构蛋白P1前体，可被病毒的蛋白酶前体3CD切割为VP0、VP1和VP3结构蛋白。这三种蛋白与病毒RNA组成病毒颗粒，VP0在组装中进一步裂解为VP2和VP4，完成成熟病毒颗粒的组装。脊髓灰质炎病毒根据血清型被分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中Ⅰ型脊髓灰质炎在3种类型中最具神经侵袭性，多数脊髓灰质炎流行及地方性流行病例都是由Ⅰ型脊髓灰质炎引起的，其次分别为Ⅲ型和Ⅱ型，且三种血清型之间并无交叉免疫保护作用。目前，临床上对于脊髓灰质炎的治疗并没有特效药，主要采取的是接种疫苗为主的预防措施。目前国内外普遍使用的用来预防脊髓灰质炎的疫苗有灭活疫苗(Inactivatedpoliovirusvaccine，IPV)和口服减毒疫苗(Oralpoliovirusvaccine，OPV)。其中IPV是由3种类型脊髓灰质炎病毒组成的混合物经过细胞培养、收获上清、纯化以及甲醛灭活等而制备的疫苗。IPV疫苗相较OPV免疫安全性好，但是接种IPV不能形成明显的肠道局部免疫，且成本显著高于OPV。由于IPV需要大量培养活病毒，因此在实验室和制备阶段也存在着泄露的危险。同时IPV中还含有猴病毒(SV40)，来自疫苗早期生产和使用过程中的原代恒河猴肾细胞，研究表明，SV40可以使培养的细胞发生转化，并可导致动物产生肿瘤。而OPV为用脊髓灰质炎病毒减毒株经培养、收获病毒液后制成的用于预防脊髓灰质炎的白色固体糖丸，其优点是价格便宜，但其存在基因回复突变和致病性等问题。目前我国广泛使用的疫苗为OPV疫苗，临床显示，与OPV相关的主要不良反应是疫苗相关麻痹性脊髓灰质炎(VAPP)。年平均VAPP的发病率为每100万人口发生0.14例，而在免疫缺陷人群中发生VAPP的风险性最高。1988年，世界卫生组织在全球启动了“消灭脊髓灰质炎”行动，通过实施疾病监测、免疫接种等策略，我国自1995年即实现了脊髓灰质炎野病毒的循环阻断。2000年，经世界卫生组织确认，包括中国在内的西太平洋地区已经基本实现了无脊灰目标；至2010年，全球只有4个本土脊灰流行的国家，其中3个和我国接壤，即印度、巴基斯坦和阿富汗，对我国病患的防治也构成一定的隐患。直至今日，全球消灭脊髓灰质炎的目标仍然没有达到，仅在2005-2009年，尼日利亚就出现了3660例脊髓灰质炎病毒感染造成的急性弛缓性麻痹患者，我国新疆维吾尔自治区也于2011年发生了Ⅰ型脊髓灰质炎野毒株输入性疫情。可见，我国对脊髓灰质炎的防治依然不容放松。随着现代生物技术的快速发展，基因工程疫苗成为了近年来新型病毒预防性疫苗主要的发展趋势。其中，基于病毒样颗粒(Virus-likeparticles，VLPs)的基因工程疫苗备受关注。病毒样颗粒是由病毒衣壳蛋白自组装而形成的不含病毒核酸的空心颗粒，具有与天然病毒衣壳蛋白相同或相似的空间构型及抗原表位，具有很强的免疫原性，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。并且由于病毒样颗粒不含有病毒的基因组，因此不具备复制能力，其安全性要优于传统的减毒活疫苗和灭活疫苗，所以病毒样颗粒疫苗的出现为研发更为安全有效的疫苗提供了一个新的契机。
技术实现思路
为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种重组脊髓灰质炎Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型病毒样颗粒，并进一步公开其制备方法，以及其在制备疫苗药物领域的应用。为解决上述技术问题，本专利技术所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：(1)取脊髓灰质炎病毒的P1基因和3CD基因分别克隆到共表达载体中，随后通过转化感受态细胞得到能够表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组病毒载体；(2)用步骤(1)得到的重组病毒载体转染昆虫细胞，培养后获得含有编码病毒样颗粒蛋白基因的重组病毒；(3)将步骤(2)获得的重组病毒感染至宿主细胞进行扩增以提高病毒滴度，随后接种高滴度的重组病毒侵染昆虫细胞，以表达上述P1基因和3CD基因，并按照常规纯化方法获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。优选的，所述步骤(1)中，所述P1基因和所述3CD基因均为根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化的基因。所述密码子优化是指在不改变野生型脊髓灰质炎病毒P1蛋白和3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型脊髓灰质炎病毒P1基因和3CD基因的密码子替换为昆虫细胞偏好的密码子。所述步骤(1)中：所述脊髓灰质炎病毒包括Ⅰ型、Ⅱ型或Ⅲ型病毒，所述脊髓灰质炎病毒Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型病毒的P1基因和3CD基因分别属于野生型脊髓灰质炎病毒的Mahoney株、MEF-1株和Saukett株。更具体的，所述脊髓灰质炎病毒为Ⅰ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；所述脊髓灰质炎病毒为Ⅱ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQIDNO:3所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；所述脊髓灰质炎病毒为Ⅲ型病毒，其优化的P1基因具有如SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，其优化的3CD基因具有如SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。所述步骤(1)中，所述共表达载体为将所述P1基因和所述3CD基因分别插入到pFastBacTMDual载体或者Dual-CMV改造载体的两个多克隆位点处各由一个启动子驱动转录得到的重组质粒；所述Dual-CMV改造载体为在pFastBacTMDual载体基础上将p10启动子改造为CMV启动子获得的改造载体。所述步骤(1)中，所述P1基因和所述3CD基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述P1基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。所述步骤(1)中，所述感受态细胞为DH10Bac感受态细胞，所获得的所述重组病毒载体为重组昆虫杆状病毒载体。所述步骤(2)中，所述目的昆虫细胞选自草地贪夜蛾卵巢细胞系sf9、sf21以及粉纹夜蛾胚胎细胞系HighFive。本专利技术还公开了由上述方法制备得到的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒。进一步的，所述重组脊髓灰质炎病毒样本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取脊髓灰质炎病毒的P1基因和3CD基因分别克隆到共表达载体中，随后通过转化感受态细胞得到能够分别表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组病毒载体；(2)用步骤(1)得到的重组病毒载体转染昆虫细胞，培养后获得含有编码病毒样颗粒蛋白基因的重组病毒；(3)将步骤(2)获得的重组病毒感染至宿主细胞进行扩增以提高病毒滴度，随后接种高滴度的重组病毒侵染昆虫细胞，以表达上述P1基因和3CD基因，并按照常规纯化方法获得脊髓灰质炎病毒样颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取脊髓灰质炎病毒的P1基因和3CD基因分别克隆到共表达载体中，随后通过转化感受态细胞得到能够表达脊髓灰质炎病毒样颗粒的重组病毒载体；(2)用步骤(1)得到的重组病毒载体转染昆虫细胞，培养后获得含有编码病毒样颗粒蛋白基因的重组病毒；(3)将步骤(2)获得的重组病毒感染至宿主细胞进行扩增以提高病毒滴度，随后接种高滴度的重组病毒侵染昆虫细胞，以表达上述P1基因和3CD基因，并按照常规纯化方法获得脊髓灰质炎病毒样颗粒；所述P1基因和所述3CD基因均为根据宿主细胞的偏好性进行密码子优化的基因；其中，所述脊髓灰质炎病毒为Ⅰ型病毒，其优化的P1基因序列如SEQIDNO:1所示，其优化的3CD基因序列如SEQIDNO:2所示；或者，所述脊髓灰质炎病毒为Ⅱ型病毒，其优化的P1基因序列如SEQIDNO:3所示，其优化的3CD基因序列如SEQIDNO:4所示；或者，所述脊髓灰质炎病毒为Ⅲ型病毒，其优化的P1基因序列如SEQIDNO:5所示，其优化的3CD基因序列如SEQIDNO:6所示。2.根据权利要求1所述的重组脊髓灰质炎病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶子和，孙瑶，王祥喜，杨盼，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11