一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法，该病毒样颗粒由一个多基因缺失的HIV前病毒质粒、一个CMV‑Gag/Pol表达质粒、一个Env表达质粒共转染细胞后分离筛选获得；多基因缺失的HIV前病毒质粒通过Gaussia萤光素酶基因序列替代病毒nef基因序列进行标记后具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列；病毒样颗粒用于制备以免疫动物生产诊断和治疗的单克隆抗体、作为树突状细胞的靶向疫苗、作为CD4+T细胞系体外感染和动物感染艾滋病病毒的感染源。本发明专利技术一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法及其应用，病毒样颗粒具有高敏感性、高安全性，并适用于无三级实验室密闭环境的不同实验室。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒样颗粒
，具体的说，涉及一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法和应用。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)是一种由HIV-1感染导致的，免疫及神经系统的退行性疾病，这种感染性疾病已经威胁到世界的生存，福利和社会稳定。HIV流行病学的全球估计表明，在2012年，世界范围内已经有3530万HIV-1携带者，且当年就有230万新增病例。即使抗HIV-1化学疗法领域在过去的几十年内有了显著的进步，由于病毒逃逸株和耐药性的迅速出现，有效地防止HIV-1的感染仍然是最重要的挑战之一。因此发展新型抗HIV的方法和更好地理解潜伏HIV复制的机制，在HIV研究领域仍然是一个迫切的任务。为了更好地发展和学习不同的抗HIV的策略，鉴于HIV-1是一种高致病性病原体，其深入研究需要在三级实验室进行分析。此外，为了评价多种新型抗HIV治疗方法，一个很重要的步骤是临床试验之前，在动物模型中测试其抗病毒效果。这种对生物安全水平的高要求限制了许多研究团队在这个特定的领域开展工作。除了体外研究，HIV研究也需要动物模型。直到现在，有两种动物模型:非人灵长类(猴子或猩猩)模型和人化鼠模型已经被用于研究HIV/SIV感染和发病机理。虽然猴子模型对于评估SIV/SHIV感染和检测一些抗HIV候选药物非常有用，但它的使用有很多限制。例如使用SIV或SHIV代替HIV并不适合一些特异性攻击HIV的策略。另外，在猴子模型中，不可能检测在HIV感染人群中基因差异和耐药性病毒。另一种动物模型，人化鼠模型能够克服这些限制。在这个模型里面，人化鼠对人类艾滋病病毒易感，而且这些动物比非人灵长类更容易处理。现在，更多实质性的改进已经被用在新一代的人化鼠模型上。许多团队已经证明这些人化鼠作为改进模型在研究HIV-1感染和CD4+T细胞损耗的功效。然而，由于HIV-1病毒的高致病性，所以在研究各类抗HIV策略时所需的防范设施要达到生物安全级别3(BSL-3)，而上述在人化鼠身上实验HIV感染同样需要在三级生物安全实验室里进行，很多科研团队为与HIV抗争做出了巨大的贡献，但因为需要高级别的安全设施，所以限制了他们继续深入研究。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供本专利技术一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法，得到的单循环复制艾滋病毒样颗粒具有具有高敏感性、高安全性，并能适用于没有三级实验室密闭环境的不同实验室。本专利技术目的是这样实现的：一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其关键在于：由一个多基因缺失的HIV前病毒质粒、一个CMV-Gag/Pol表达质粒、一个Env表达质粒共转染细胞后分离筛选获得；所述多基因缺失的HIV前病毒质粒通过Gaussia萤光素酶基因序列替代nef基因序列进行标记后具有序列表中SEQIDNO.1所述的碱基序列。优选地，上述CMV-Gag/Pol表达质粒表达的蛋白含有病毒壳蛋白、逆转录酶和聚合酶。优选地，上述CMV-Gag/Pol表达质粒具有序列表中SEQIDNO.2所述的碱基序列。优选地，上述Env表达质粒具有序列表中SEQIDNO.3所述的碱基序列。一种单循环复制艾滋病毒样颗粒的制备方法，其关键在于按以下步骤进行：将多基因缺失的HIV前病毒质粒、CMV-Gag/Pol表达质粒和Env表达质粒共转染进离体人类细胞，分离复制后，对细胞液进行超速离心，在细胞上清液中收集得到单循环复制艾滋病毒样颗粒，即C-ΔRI/ΔE/Gluc。优选地，上述离体人类细胞为293T细胞、293细胞、cos-7细胞、BHK细胞、NIH3T3细胞或Hela细胞或各种CD4+T细胞系。一种单循环复制艾滋病毒样颗粒在制备以免疫动物生产诊断和治疗单克隆抗体的应用。一种单循环复制艾滋病毒样颗粒在制备作为树突状细胞的靶向疫苗中的应用。一种单循环复制艾滋病毒样颗粒在各种CD4+T细胞系包括人原代CD4+T细胞、人原代单核细胞、巨噬细胞体外感染研究中作为感染源的应用。优选地，上述病毒样颗粒用于各种CD4+细胞系包括人原代CD4+T细胞、人原代单核细胞、巨噬细胞移植的裸鼠的感染研究中的作为感染源的应用，包括作为感染源用于检测各种疫苗，抗病毒药物或中和抗体体内有效性研究的质量检测。有益效果：本专利技术一种单循环复制艾滋病毒样颗粒及其制备方法，该病毒样颗粒表达一种分泌型荧光素酶作为生物标记，便于观察跟踪，而且该病毒样颗粒能在多个培养细胞系中进行单一周期复制，具有高敏感性，该病毒感染系统被完全限制在一个周期内，不能突变为野生型病毒，具有高安全性，因此，适用于没有三级实验室密闭环境的不同实验室进行多种HIV-1的研究，包括动物实验。附图说明图1A为本专利技术中ΔRI/ΔE/Gluc质粒、CMV-Gag/Pol表达质粒、病毒包膜糖蛋白Env表达质粒的构建体；图1B为检测C-ΔRI/ΔE/Gluc和没补充型单周期复制病毒样颗粒(ΔRI/ΔE/Gluc)蛋白组成的放射自显影分析图；图1C为检测Gluc活性曲线图；图1D为检测HIVp24水平和Gluc活性的柱形图；图2A为用抗体做westernblot检测HIVGag蛋白和调节基因Tat，Vpr，Vif的表达结果图；图2B为细胞上清液Gluc活性的柱形图，其中上图为C-ΔRI/ΔE/Gluc病毒感染CD4+C8166T细胞5天后传代，每代培养5天，传7代，每代中细胞上清液Gluc活性的柱形图，下图为用每代被感染的T细胞的上清来培养新的MT4细胞，培养10天后再收集上清并检测Gluc活性的柱形图；图3A为C-ΔRI/ΔE/Gluc病毒感染初始CD4+T细胞，通过检测Gluc活性的曲线图；图3B为C-ΔRI/ΔE/Gluc病毒感染单核巨噬细胞，通过检测Gluc活性的曲线图；图3C为C-ΔRI/ΔE/Gluc病毒感染初始CD4+T细胞，通过抗Gagp24ELISA来定量病毒感染水平的曲线图；图3DC-ΔRI/ΔE/Gluc病毒感染单核巨噬细胞，通过抗Gagp24ELISA来定量病毒感染水平的曲线图；图4A的左图为检测Gluc的活性的柱形图，图4A的右图为检测HIV-1p24的水平的柱形图；图4B为细胞做Westernblot检测的结果；图5A为感染实验设计图；图5B为裸鼠腹腔液(左图)和血液(右图)进行Gluc活性检测的柱形图；图5C为感染本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其特征在于：由一个多基因缺失的HIV前病毒质粒、一个CMV‑Gag/Pol表达质粒、一个Env表达质粒共转染细胞后分离筛选获得；所述多基因缺失的HIV前病毒质粒通过Gaussia萤光素酶基因序列替代nef基因序列进行标记后具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。

【技术特征摘要】
2016.01.07 CN 20161001028561.一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其特征在于：由一个多基因缺失的
HIV前病毒质粒、一个CMV-Gag/Pol表达质粒、一个Env表达质粒共转染细胞
后分离筛选获得；所述多基因缺失的HIV前病毒质粒通过Gaussia萤光素酶基
因序列替代nef基因序列进行标记后具有序列表中SEQIDNO.1所述的碱基序
列。
2.根据权利要求1所述的一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其特征在于：
所述CMV-Gag/Pol表达质粒表达的蛋白含有病毒壳蛋白、逆转录酶和聚合酶。
3.根据权利要求2所述的一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其特征在于：
所述CMV-Gag/Pol表达质粒具有序列表中SEQIDNO.2所述的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的一种单循环复制艾滋病毒样颗粒，其特征在于：
所述Env表达质粒具有序列表中SEQIDNO.3所述的碱基序列。
5.一种任一项权利要求1～4所述的单循环复制艾滋病毒样颗粒的制备方法，
其特征在于按以下步骤进行：将多基因缺失的HIV前病毒质粒、CMV-Gag/Pol
表达质粒和Env表达质粒共转染进离体人...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚小剑，姚小刚，敖竹君，欧阳清检，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43