一种凝血酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种凝血酶的制备方法，其包括：过滤除去猪血浆中的杂质；加入病毒灭活试剂进行病毒灭活处理；加入吸附剂吸附凝血酶原；洗涤和浸泡吸附凝血酶原的吸附剂，再进行透析；激活经透析的溶液中的凝血酶原；将溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；经超滤膜过滤；经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；制成制剂。该制备方法在进一步稳定凝血酶产品的效价的基础上，更有效地减少了凝血酶产品中的杂质及降低杂蛋白浓度，并使病毒充分灭活后被除去。

【技术实现步骤摘要】
一种凝血酶的制备方法
本专利技术属于生化制药领域，涉及一种凝血酶的制备方法，具体涉及一种有效降低杂质和去除/灭活病毒、效价稳定的凝血酶的制备方法。
技术介绍
凝血酶是一种广泛存在于人体和动物血液中的丝氨酸蛋白酶，它是血液凝血级联反应中的主要效应蛋白酶，显现出促凝和抗凝的特性。当循环凝血因子在暴露的血管外组织与组织因子相接触时，凝血酶会在组织上聚集。凝血酶通过激活血小板催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，促进血块稳定，从而在血栓性疾病的引发和发展中发挥核心作用。由于凝血酶能直接作用于血液中的纤维蛋白原，促使其转变为纤维蛋白、加速血液的凝固而止血，因此临床上将其用于外伤、手术、口腔、耳鼻咽喉、泌尿、妇产科、消化道出血的止血，特别是用于手术中不易结扎的小血管止血、消化道出血及外伤出血等。目前，临床上应用的凝血酶主要是由人血以及猪、牛等动物血分离提取的。其中，由于猪血来源充分，原料成本低等因素，所以大量凝血酶产品都是由猪血制备的，少量的是由人血及牛血等血液制备的。但是，不论是从动物血还是从人血制备的凝血酶产品，现有的制备方法都会存在以下几个问题：(1)凝血酶产品效价不稳定；(2)产品杂质及杂蛋白浓度偏高；(3)存在引入各种病毒的风险，这些都会限制凝血酶产品的临床应用，并造成安全隐患。中国专利技术专利申请CN1031160486(以下简称在先专利)公开了一种猪凝血酶的制备方法，该方法包括以下步骤：一、分离猪血浆；二、化学法病毒灭活；三、吸附凝血酶原；四、收集凝血酶原；五、纳米过滤；六、凝血酶原的活化；七、凝血酶的冻干保存。该专利申请并未公开用于病毒灭活的试剂和纳米膜的种类，而且所述方法得到的产品杂质含量偏高，其产品的效价也有待进一步提高。
技术实现思路
为了克服现有技术的上述缺陷，本专利技术的目的在于提供一种凝血酶的制备方法，该制备方法在进一步提高凝血酶产品的效价的基础上，更有效地去除了凝血酶产品中的杂质并使病毒充分灭活后被除去。用于实现上述目的的技术方案如下：一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)过滤除去猪血浆中的杂质；(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。在上述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆；优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆；更优选地，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆；优选地，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液；进一步优选地，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用；优选地，所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤。在上述制备方法的步骤(2)中，优选地，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的TritonX-100的水溶液。在上述制备方法的步骤(3)中，优选地，所述吸附剂为DEAE-SephadexA-50型离子交换树脂；优选地，所述吸附剂与血浆的质量比为0.5～2.5：1000，优选为1.5：1000。在上述制备方法的步骤(4)中，优选地，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升～200毫升：1000克，更优选为160毫升：1000克。在上述制备方法的步骤(5)中，优选地，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升～60毫升：1000克，更优选为35毫升：1000克。在上述制备方法的步骤(6)中，优选地，所述透析用溶液与血浆的比为2500毫升～3500毫升：1000克，更优选为3000毫升：1000克。在上述制备方法的步骤(8)中，优选地，采用1摩尔/升冰醋酸水溶液将pH调节至5.2-5.6；优选地，采用饱和碳酸氢钠溶液将pH调节至6.0-6.5。在上述制备方法的步骤(9)中，优选地，所述膜吸附器为纤维素膜吸附器，例如SartobindQSingleSep型囊式膜吸附器；优选地，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液，再用浓度为0.25mol/L的NaCl水溶液。在上述制备方法的步骤(10)中，优选地，所述超滤膜的截留分子量为10K-150K；更优选地，所述超滤膜过滤为先用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为10K的超滤膜过滤；进一步优选地，所述截留分子量为150K的超滤膜为截留分子量为150K的中空纤维聚偏氟乙烯超滤膜，所述截留分子量为10K的超滤膜为截留分子量为10K的中空纤维聚砜超滤膜。在上述制备方法的步骤(11)中，优选地，所述过滤除菌的滤膜依次为0.8μm、0.45μm和0.22μm的聚偏二氟乙烯膜。在本专利技术的一个优选的技术方案中，所述凝血酶的制备方法包括以下步骤：(1)在20±2℃下，分别经70目、100目、200目滤网过滤除去经过抗凝预处理猪血浆中的杂质；(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，在24℃下进行病毒灭活处理4-6小时；所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的TritonX-100的水溶液；(3)在20±2℃下，向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，搅拌45分钟后静置30分钟以吸附凝血酶原，经200目滤布过滤后抽滤；所述吸附剂与血浆的质量比为1.5：1000；(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克；(5)在室温下，将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)过滤除去猪血浆中的杂质；(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33‑36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2‑5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0‑6.5，静置；(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液。(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂。...

【技术特征摘要】
1.一种凝血酶的制备方法，该制备方法包括以下步骤：(1)过滤除去猪血浆中的杂质；所述过滤为分别经70目、100目、200目滤网过滤；(2)向步骤(1)得到的过滤的猪血浆加入病毒灭活试剂，进行病毒灭活处理；(3)向步骤(2)得到的经病毒灭活处理的猪血浆加入吸附剂，吸附凝血酶原，抽滤；(4)以包含11.7克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液洗涤步骤(3)得到的吸附凝血酶原的吸附剂；(5)将步骤(4)得到的吸附凝血酶原的吸附剂浸泡于包含117克/升氯化钠、3克/升柠檬酸三钠的水溶液中，抽滤；(6)将步骤(5)得到的滤液置于2.94克/升柠檬酸三钠水溶液中，进行透析；(7)将步骤(6)得到的经透析的溶液加热至33-36℃，加入体积比为7％的溶液A，再加入体积比为7％的溶液B和体积比为7％的溶液C，搅拌后静置；其中，所述溶液A为以35克/升的浓度将氯化钙溶于9克/升的NaCl水溶液并经加热搅拌后离心得到的上清液；溶液B为向步骤(6)得到的经透析的溶液加入体积比为7％的溶液A并搅拌后，加入体积比为7％的1摩尔/升的氯化钙水溶液制得的溶液；溶液C为1摩尔/升的氯化钙水溶液；(8)将步骤(7)得到的溶液的pH调节至5.2-5.6，静置后离心，将上清液的pH调节至6.0-6.5，静置；(9)将步骤(8)得到的上清液通过膜吸附器后，洗脱得到洗脱液；所述膜吸附器为SartobindQSingleSep型囊式膜吸附器，所述洗脱的洗脱剂为先用浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液，再用浓度为0.25mol/L的NaCl水溶液；(10)将步骤(9)得到的洗脱液经超滤膜过滤；(11)将步骤(10)得到的滤液经滤膜过滤除菌，再经孔径为20nm的过滤器过滤除去病毒；(12)将步骤(11)得到溶液制成制剂；在所述制备方法的步骤(10)中，所述超滤膜过滤为先用截留分子量为150K的超滤膜过滤，再用截留分子量为10K的超滤膜过滤。2.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(1)中，所述猪血浆为经过抗凝预处理的猪血浆。3.根据权利要求2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入抗凝剂，静置后离心，收集上层血浆。4.根据权利要求2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述抗凝预处理包括以下步骤：向新鲜的猪血加入体积比为1/9的抗凝剂，轻轻搅匀，在0-10℃下静置后，并于5-8小时内离心，离心温度为8-15℃，离心时间为15-20分钟，收集上层血浆。5.根据权利要求3或4所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述抗凝剂为38克/升的柠檬酸三钠水溶液。6.根据权利要求2所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述经过抗凝预处理的猪血浆在0-10℃下保存0-6小时或者-18℃以下冰冻贮存二年以内备用。7.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(2)中，所述病毒灭活试剂为体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和重量比浓度为1％的吐温-80的水溶液，或者体积比浓度为0.3％的磷酸三丁酯和体积比浓度为1％的TritonX-100的水溶液。8.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在上述制备方法的步骤(3)中，所述吸附剂为DEAE-SephadexA-50型离子交换树脂。9.根据权利要求8所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述吸附剂与血浆的质量比为0.5～2.5：1000。10.根据权利要求9所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，所述吸附剂与血浆的质量比为1.5：1000。11.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(4)中，所述洗涤用溶液与血浆的比为100毫升～200毫升：1000克。12.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(4)中，所述洗涤用溶液与血浆的比为160毫升：1000克。13.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(5)中，所述浸泡用溶液与血浆的比为20毫升～60毫升：1000克。14.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(5)中，所述浸泡用溶液与血浆的比为35毫升：1000克。15.根据权利要求1所述的凝血酶的制备方法，其特征在于，在所述制备方法的步骤(6)中，所述透析用溶液与血浆的比为...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵春杰，
申请(专利权)人：长春远大国奥制药有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22