一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法技术

本发明专利技术公开了一种测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯的浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法。
技术介绍
8-表黄独素E乙酸酯(8-epidiosbulbin E acetate)是从薯蓣科薯蓣属多年生草本植物黄独(Dioscorea bulbifera L.)的干燥块茎中分离得到的呋喃正二萜类新化合物。体外实验证明8-表黄独素E乙酸酯具有显著的抗肿瘤、抗真菌、抗炎等生物活性，是一种具有良好开发前景的新药源化合物。其结构式如下：目前尚未关于8-表黄独素E乙酸酯体内测定方法的文献报道。本专利技术建立了8-表黄独素E乙酸酯在大鼠体内的测定方法，通过该方法对8-表黄独素E乙酸酯的药物代谢情况进行探索性研究。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是建立一种准确高效测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱；流动相：体积比为70∶30的甲醇与0.1％甲酸水溶液；流速：0.2-0.5mL·min-1；柱温：30-40℃；进样量5μL；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，Fragmentor 110，Collision Energy 10；(4)计算：采用内标法，以8-表黄独素E乙酸酯和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算8-表黄独素E乙酸酯的浓度。步骤(1)中，取血浆样品50μL，加入内标800ng·mL-1替硝唑甲醇溶液10μL和190μL甲醇或乙腈，振荡3min，12000rpm离心10min，离心后取上清液。步骤(2)中，色谱柱长度为100mm，内径为2.0mm，填料粒径为3μm。其中，所述的血浆为给予了含8-表黄独素E乙酸酯药物的血浆。其中，所述血浆为人或动物的血浆。其中，所述血浆为大鼠血浆。有益效果：本专利技术方法与现有技术相比具有如下优势：(1)预处理方法简便：一步有机溶媒蛋白沉淀法，适用于常规测定。(2)专属性强：采用Phenomenex Gemini C18色谱柱作为固定相，甲醇和水的混合液作为流动相，等度洗脱，8-表黄独素E乙酸酯保留时间为1.5min左右，内标替硝唑保留时间为1.3min左右，2min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。(3)灵敏度高：血浆最低定量限为1ng·mL-1。(4)本专利技术方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为8-表黄独素E乙酸酯的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为1～1000ng·mL-1，日内和日间精密度RSD均小于8.4％。附图说明图1为甲醇加入8-表黄独素E乙酸酯和内标对照品的质谱图。图2为大鼠空白血浆的质谱图。图3为大鼠空白血浆加入8-表黄独素E乙酸酯和内标对照品的质谱图。图4为大鼠给予8-表黄独素E乙酸酯后血浆样品再加入内标对照品的的质谱图。注：图1～图4中离子通道1为8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，保留时间为1.5min左右；离子选择通道2为内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，保留时间为1.3min左右。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例：大鼠血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的测定一、实验材料与仪器8-表黄独素E乙酸酯：分离自黄独的干燥块茎；替硝唑(内标)：购于中国药品生物制品检定所，批号：100336-200703；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯(Merck Company)。Agilent G6430LC-MS/MS液质联用仪(美国Agilent公司，所配高效液相仪为Agilent 1290)；MassHunter数据处理系统(version B.05.00)；WH-2微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；AE240电子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Millipore Drict-Q5纯水机(法国Millipore公司)；Biofuge PrimoR冷冻高速离心机(德国Heraeus公司)。二、液质条件1.液相色谱条件色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(dp 3μm，100mm ID×2.0mm)；流动相：甲醇-0.1％甲酸水溶液(70∶30，v/v)；流速：0.2mL·min-1；柱温：35℃。2.质谱条件离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，Fragmentor 110，Collision Energy 10。三、实验过程：1.8-表黄独素E乙酸酯标准溶液的配制：精密称取8-表黄独素E乙酸酯10.14mg，置于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.014mg·mL-18-表黄独素E乙酸酯的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释，配成浓度分别为5、25、50、100、250、500、1000、2500、5000ng·mL-1的8-表黄独素E乙酸酯标准溶液。2.大鼠血浆样品的采集与处理：大鼠尾静脉注射8-表黄独素E乙酸酯溶液，给药量为1mg·kg-1，于注射前及注射后5、10、20、30、45min、1、2、2.5、3、4h眼眶采血200μL，注入肝素管内，3000rpm离心10min，制备血浆。取大鼠血浆50μL，加入800ng·mL-1内标替硝唑甲醇溶液10μL，甲醇190μL，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。3.专属性：取没有给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠空白血浆50μL，加入200μL甲醇，振荡3min进行蛋白沉淀，12000rpm离心10min，上清液5μL进样分析。取1.5mL塑料离心管数支，加入8-表黄独素E乙酸酯标准溶液10μL，40℃氮气吹干，加入没有给予过8-表黄独素E乙酸酯的大鼠空白血浆50μL，旋涡30s混匀，加入替硝唑甲醇溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定血浆中8‑表黄独素E乙酸酯浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱；流动相：体积比为70∶30的甲醇与0.1％甲酸水溶液；流速：0.2‑0.5mL·min‑1；柱温：30‑40℃；进样量：5μL；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8‑表黄独素E乙酸酯，[M‑Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M‑H]+，m/z 248.2→121.0，Dwell 100，Fragmentor 110，Collision Energy 10。(4)计算：采用内标法，以8‑表黄独素E乙酸酯和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算8‑表黄独素E乙酸酯的浓度。...

【技术特征摘要】
1.一种测定血浆中8-表黄独素E乙酸酯浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：(1)血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；(2)将步骤(1)预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱；流动相：体积比为70∶30的甲醇与0.1％甲酸水溶液；流速：0.2-0.5mL·min-1；柱温：30-40℃；进样量：5μL；洗脱方式为等度洗脱；(3)质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；毛细管电压：4000V；干燥气温度：400℃；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：8-表黄独素E乙酸酯，[M-Na]+，m/z 411.1→351.0，Dwell 100，Fragmentor 150，Collision Energy 25；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.2→121.0，Dwel...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴国梁，张农山，刘史佳，居文政，吴磊，张倩，李长印，
申请(专利权)人：江苏省中医院，
类型：发明
国别省市：江苏;32