一种制备高纯度凝血酶的方法技术

本发明专利技术提供了一种从低纯度凝血酶制备高纯度凝血酶的方法。该方法是利用层析介质吸附低纯度凝血酶溶液，对层析柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，再经凝胶层析，超滤脱盐浓缩，最后冻干得高纯度凝血酶成品。该方法在常温常压下进行，工艺环保，生产周期短；凝血酶提取效率高，由本发明专利技术制备高纯度凝血酶，其得率为８０％以上；操作简单，本发明专利技术仅需离心、离子交换层析、凝胶层析、超滤脱盐浓缩和冻干等几个步骤，容易实现工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其是以动物血液低纯度凝血酶为原料制备高纯度凝血酶的方法。
技术介绍
凝血酶是血浆凝血酶系统中的一种具有高度特异性的丝氨酸蛋白酶，它在纤维蛋白原上的酶切位点为Gly-Gly-Val-Arg-↓-Gly-Pro-Arg-↓-。因此它在基因工程所得到的融合蛋白产品的后续加工处理中具有独特作用。为达到此用途，必须使用高纯度的凝血酶。现有技术制备方法一般包括三个基本步骤，即提取、纯化和冻干(或制剂)。我国专利CN200410074753.3、CN92112188.1、CN93110426.2和CN96103650.8分别提出了从猪血、牛血、羊血等动物血液中提取凝血酶的方法，这些方法制备的凝血酶都是低纯度凝血酶，也称作低活性凝血酶，其凝血酶比活一般小于400IU/mg蛋白，低纯度凝血酶无法满足基因工程技术方面的需要。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺流程简单、生产周期短和收率高的制备高纯度凝血酶的方法。本专利技术制备凝血酶的方法包括以下几个步骤(1)、将低纯度凝血酶用缓冲剂溶解，离心分离，收集上清液；(2)、将上清凝血酶溶液上阳离子层析柱层析，对层析柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得凝血酶溶液； (3)、将步骤(2)中得到的凝血酶溶液上凝胶柱，对凝胶柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得到高纯度的凝血酶溶液；(4)、将高纯度凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得高纯度凝血酶浓缩液；(5)、将高纯度凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状高纯度凝血酶成品。本专利技术制备高纯度凝血酶的方法中，所述的低纯度凝血酶来源于猪血、牛血、羊血等动物血液或人血液。本专利技术的方法中，步骤(1)所使用的缓冲剂是柠檬酸-磷酸盐缓冲剂或者磷酸盐缓冲剂。缓冲剂的pH值为5～7。柠檬酸-磷酸盐溶液或者磷酸盐溶液的浓度是0.01～0.025mol/L。本专利技术的方法中，步骤(2)对层析柱进行洗脱，所使用的洗脱剂是由基础液和梯度液组成。所述的基础液是调节pH值为5～7，柠檬酸-磷酸盐溶液或者磷酸盐溶液的浓度是0.01～0.025mol/L的缓冲剂。所述梯度液是调节pH值为5～7，以浓度是0.01～0.025mol/L的柠檬酸-磷酸盐溶液或者磷酸盐溶液为缓冲液，和0.5～1mol/L的氯化钠或者其它无机盐为离子增强剂组成的的混合液。本专利技术的方法中，步骤(3)对凝胶柱进行洗脱，所使用的洗脱剂是调节pH值为5～7，柠檬酸-磷酸盐溶液或者磷酸盐溶液的浓度是0.01～0.025mol/L的缓冲剂。本专利技术具有如下优点1、本专利技术提供的高纯度凝血酶纯化方法在常温常压下进行；2、凝血酶的收率高，其收率为80％以上；3、操作简单。4、工艺周期短，整个工艺生产仅需3天(包括冻干)左右。具体实施例方式实施例1称取猪低纯度凝血酶6克，加入0.025mol/L，pH为5.8的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂400ml，充分溶解，高速离心，收集上清液A1。取上清凝血酶溶液A1上已平衡好的阳离子层析柱，用调节pH为5.8，浓度为0.025mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂作为基础液；用调节pH为5.8，浓度为0.025mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂以及氯化钠浓度为0.5mol/L组成的混合液作为梯度液；由上述基础液和梯度液组成的梯度洗脱剂对层析柱进行梯度洗脱，收集凝血酶活性峰A2，得凝血酶洗脱液410ml。将收集得来的凝血酶溶液A2上Sephadex G-100凝胶柱，对凝血酶溶液A2进行凝胶层析，洗脱并收集凝血酶活性峰A3，得到高纯度凝血酶浓液200ml。将凝血酶溶液A3进行超滤脱盐，得到凝血酶溶液低盐浓溶液50ml，标记为A4。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状高纯度凝血酶。实施例2称取牛低纯度凝血酶6.5克，加入0.025mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂400ml，充分溶解，高速离心，收集上清液B1。取上清凝血酶溶液B1上已平衡好的阳离子层析柱，用调节pH为7.0，浓度为0.025mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂作为基础液；用调节pH为7.0，浓度为0.025mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂以及氯化钠浓度为1mol/L组成的混合液作为梯度液；由上述基础液和梯度液组成的梯度洗脱剂对层析柱进行梯度洗脱，收集凝血酶活性峰B2，得凝血酶洗脱液360ml。将收集得来的凝血酶溶液B2上Sephadex G-100凝胶柱，对凝血酶溶液B2进行凝胶层析，洗脱并收集凝血酶活性峰B3，得到高纯度凝血酶浓液220ml。将凝血酶溶液B3进行超滤脱盐，得到凝血酶溶液低盐浓溶液50ml，标记为B4。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状高纯度凝血酶。实施例3称取羊低纯度凝血酶4.7克，加入0.01mol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲剂400ml，充分溶解，高速离心，收集上清液C1。取上清凝血酶溶液C1上已平衡好的阳离子层析柱，用调节pH为6.5，浓度为0.01mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂作为基础液；用调节pH为6.5，浓度为0.01mol/L的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲剂以及氯化钠浓度为1mol/L组成的混合液作为梯度液；由上述基础液和梯度液组成的梯度洗脱剂对层析柱进行梯度洗脱，收集凝血酶活性峰C2，得凝血酶溶液320ml。将收集得来的凝血酶溶液C2上Sephadex G-100凝胶柱，对凝血酶溶液C2进行凝胶层析，洗脱并收集凝血酶活性峰C3，得到高纯度凝血酶浓液190ml。将凝血酶溶液C3进行超滤脱盐，得到凝血酶溶液低盐浓溶液50ml，标记为C4。冻干上述凝血酶浓液，即得白色的粉状高纯度凝血酶。实施例4按照《中华人民共和国药典》2000版二部第1056～1057页的有关凝血酶效价标准检测方法，作标准曲线，对上述凝血酶溶液Ai(A1、A2、A3、A4)，Bi(B1、B2、B3、B4)，Ci(C1、C2、C3、C4)进行效价检测，检测结果见表1；采用Bradord检测法对上述溶液进行蛋白浓度检测，检测结果如表1所示。根据凝血酶效价检测结果以及相应的蛋白浓度检测结果，计算凝血酶比活和得率(％)，其结果如表2所示。表1实验检测数据 表2凝血酶效价检测及分析结果 权利要求1.，该方法包括以下几个步骤(1)、将低纯度凝血酶用缓冲剂溶解，离心分离，收集上清液；(2)、将上清凝血酶溶液上阳离子层析柱层析，对层析柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得凝血酶溶液；(3)、将步骤(2)中得到的凝血酶溶液上凝胶柱，对凝胶柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得到高纯度的凝血酶溶液；(4)、将高纯度凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得高纯度凝血酶浓缩液；(5)、将高纯度凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状高纯度凝血酶成品。2.根据权利要求1所述的制备高纯度凝血酶的方法，其特征在于所述的低纯度凝血酶来源于猪血、牛血、羊血或人血液。3.根据权利要求1所述的制备高纯度凝血酶的方法，其特征在于步骤(1)所使用的缓冲剂是柠檬酸-磷酸盐缓冲剂或者磷酸盐缓冲剂。4.根据权利要求3所述的制备高纯度凝血酶的方法，其特征在于缓冲剂的pH值为5～7。5.根据权利要求3或4所述的制备凝血酶的方法，其特征在于柠檬酸-磷酸盐溶液或者磷酸盐溶液的浓度是0.01～0.025mol/L。6.根本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备高纯度凝血酶的方法，该方法包括以下几个步骤：（１）、将低纯度凝血酶用缓冲剂溶解，离心分离，收集上清液；（２）、将上清凝血酶溶液上阳离子层析柱层析，对层析柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得凝血酶溶液；（３）、将步 骤（２）中得到的凝血酶溶液上凝胶柱，对凝胶柱进行洗脱，收集凝血酶蛋白峰，得到高纯度的凝血酶溶液；（４）、将高纯度凝血酶溶液进行超滤脱盐浓缩，得高纯度凝血酶浓缩液；（５）、将高纯度凝血酶浓缩液冻干，即得白色的粉状高纯度凝血酶成 品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄耀江，王永成，裴靖，
申请(专利权)人：黄耀江，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]