【技术实现步骤摘要】
羊布鲁氏菌重组菌株M5- Δ znuA及制备方法与应用
本专利技术属于重组细菌疫苗领域，特别涉及一株羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)重组菌株Μ5-Δ znuA及制备方法与应用。
技术介绍
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌疫苗种类较多，传统弱毒苗造价便宜、免疫保护持续时间长、免疫保护效率高，但存在毒性较大易返祖、无法区分人工免疫与自然感染等缺点；重组蛋白疫苗与DNA疫苗具有安全性高、制备工艺简单、方便储藏运输等优点，但也存在免疫效果差、保护性有限的缺点；灭活疫苗虽在使用时较安全，但由于保护期短、制备成本高而难以广泛应用。目前，用于布鲁氏菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号弱毒菌株(S19)和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号(M5)弱毒菌株和猪型2号(S2)弱毒菌株,但是弱毒疫苗同样存在缺陷，这些光滑型布鲁氏菌弱毒疫苗免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，很难与野毒株布鲁氏菌感染相区分从而干扰常规布鲁氏菌病的诊断。若广泛应用这样的疫苗就对该病流...
【技术保护点】
一株羊布鲁氏菌重组菌株M5?ΔznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）自杀性同源重组质粒的构建①以羊布鲁氏菌（Brucella?melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；P1：5′?GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC?3′；P2：5′?TCGCTGAAAGACTGCCTGT?3′；P3：5′?GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC?3′；P4：5′?AGAGAGCTCCAATGTCCCCTT...
【技术特征摘要】
1.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (O自杀性同源重组质粒的构建 ①以羊布鲁氏菌(Brucellame I i tens i s ) M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为Pl和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；Pl:5/ -GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3/ ；P2:5/ -TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3'；P3:5/ -GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3/ ；P4:5/ -AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3'； ②利用OverlapPCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，Pl和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段Λ znuA ； ③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΛznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Λ znuA和载体片段PRE112连接，得到自杀性同源重组质粒 pRE- Δ znuA ； (2)羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选 ①将自杀性同源重组质 粒pRE-AznuA导入羊布鲁氏菌M5的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子^fPCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB-YE培养基中培养，松弛质粒抗性； ②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒PRE- Δ znuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物Pl和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-AznuA; 所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下:胰蛋白胨...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金顶，马思思，王佳莹，刘翠翠，吴云燕，赵明秋，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：
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