一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，属于免疫学的技术领域。本发明专利技术利用重组布鲁氏菌Omp19外膜蛋白作为抗原蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过免疫印迹试验进行人或者家畜动物血清的免疫识别，根据免疫印迹的结果可以直接判断人与家畜体内是否存在布鲁氏菌。本发明专利技术可以作为检测人或者家畜体内是否存在布鲁氏菌的重要方法，在我国广大农牧业养殖区的布鲁氏菌病的快速、准确检测方面有较大的应用空间。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术涉及，属于免疫学的
。本专利技术利用重组布鲁氏菌Omp19外膜蛋白作为抗原蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过免疫印迹试验进行人或者家畜动物血清的免疫识别，根据免疫印迹的结果可以直接判断人与家畜体内是否存在布鲁氏菌。本专利技术可以作为检测人或者家畜体内是否存在布鲁氏菌的重要方法，在我国广大农牧业养殖区的布鲁氏菌病的快速、准确检测方面有较大的应用空间。【专利说明】
本专利技术涉及，属于免疫学的
。
技术介绍
在我国北方广大农牧养殖区，包括内蒙古、青海、西藏、新疆以及东北地区，成规模爆发的布鲁氏菌病时有发生，引起这种疾病的细菌被称为布鲁氏菌，它主要在牧区的牛、羊、猪身上寄生，而且，可以通过多种途径直接传染给人，例如空气传染、食用肉制品传染、体液传染等等。比较棘手的一个问题是，到目前为止我国科研工作者仍然没有研制出效果良好的可供人使用的布鲁氏菌病疫苗，所以，一旦出现布鲁氏菌感染人的情况，往往感染后果不堪设想，所以，针对布鲁氏菌病的现状，摆在科研工作者面前的第一个科学难题就是布鲁氏菌可以在人畜之间多途径传染，造成“难防”的局面。此外，一旦布鲁氏菌从家畜体内传染到人的体内，造成的感染后果几乎是不能用现有的抗生素来完全治愈的，这也给科研工作者提出了第二个难题，那就是布鲁氏菌病“难治”的局面，因为这种在家畜和人体内都可以寄生的布鲁氏菌，不能被目前现有的抗生素彻底清除，往往出现病情反复、越来越严重的后果，甚至出现患者丧失劳动能力的严重后果。因此，针对布鲁氏菌病“难防、难治”的局面，我们首先应该研究出一套切实可行、快速准确的判定人或者家畜是否患布鲁氏菌病的技术，从而，为临床实际中从事布鲁氏菌病诊断与治疗的人医和兽医医务工作者提供一个科学的判断依据。此前，多数从事布鲁氏菌与布鲁氏菌病研究的科研工作者是从布鲁氏菌本身的鉴定出发，来确定家畜或者人的体内是否存在布鲁氏菌，常用的技术就是PCR扩增技术，将家畜动物或者人的血液作为PCR反应的模板，根据布鲁氏菌基因组中的保守序列，设计特殊的扩增引物来检测受测试样品是否能够扩增到目的基因片段，一次来判断受测试样品中是否存在布鲁氏菌。现在看来，这种技术仍然存在一些缺点:第一，PCR扩增技术的扩增结果很容易受到外界因素的干扰而出现假阳性。第二，PCR扩增技术本省需要耗费较多的精密仪器和大量资金。第三，PCR扩增技术本身较为繁琐和复杂，不利于推广和应用。因此，需要一种简单、快速判定的方法。那么，血清学快速诊断技术就可以解决以上这些问题，一旦家畜或者人体感染布鲁氏菌之后，家畜或者人体的免疫系统就会发挥免疫作用，针对这一细菌产生大量的、各种类型的抗体来清除细菌。因此，一旦家畜或者人体的血清中存在针对布鲁氏菌的抗体，那么可以肯定地判断一定是感染了布鲁氏菌，不会出现假阳性的现象。而且，利用布鲁氏菌自身的抗原蛋白质来识别家畜和人的血清中的抗体，反应特别灵敏，涉及到的试验技术简单、仪器设备普通，便于技术的推广和应用。布鲁氏菌在入侵家畜动物和人体过程的免疫识别阶段，主要依靠布鲁氏菌细菌表面的抗原决定簇来刺激机体产生抗体，从蛋白质的氨基酸结构来讲，这些暴露在细菌表面的抗原决定簇主要存在于布鲁氏菌外膜蛋白质(简称Omp蛋白)的氨基酸序列中，因此，利用大肠杆菌原核表达系统进行布鲁氏菌外膜蛋白的重组表达，获得的重组蛋白可以识别因布鲁氏菌感染而在动物和人体内产生的抗体，达到鉴定的效果。因此，本专利技术选择布鲁氏菌基因组中进化十分保守、在不同种的布鲁氏菌中基因序列完全一致的Ompl9外膜蛋白进行重组表达，通过蛋白质电泳技术和免疫印迹实验技术，应用此Ompl9外膜蛋白进行家畜动物和人体的血清中布鲁氏菌抗体的检测，来判定家畜动物或者人是否感染布鲁氏菌，在临床实际布鲁氏菌病的确诊方面有较大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法能够快速、准确检测人和家畜体内有无布鲁氏菌。技术解决方案:本专利技术采用布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白进行重组表达。本专利技术方法步骤如下:I)布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白表达片段的克隆:根据美国国家生物技术中心网站公布的多种生物型的布鲁氏菌基因组信息，我们选择了保守性极高的布鲁氏菌的0mpl9外膜蛋白质基因进行研究，因为这个基因在不同生物型的布鲁氏菌中的序列是完全一致的，具有极高的保守性，所以它的应用范围会更广，之后，我们设计了目的基因表达引物0mpl9-F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 #口 0mpl9_R:5 —tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'用于目的基因表达片段的克隆，将从当地疾病控制中心购买来的家畜用的S2活菌疫苗瓶在沸水域中煮沸30min，之后取I ii L-2ii L作为PCR扩增目的基因表达片段的模板进行PCR反应，具体程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液；2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(I)中的回收后的布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，之后，在16°C金属浴中进行T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)过夜连接，获得连接产物；3)转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5 a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培养基平板；4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物Ompl9_F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和弓I物 Ompl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min,之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸IOmin, PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37°C过夜液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行质粒提取，得到阳性重组质粒；6)转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株:将步骤(5)中的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培养基平板；7)阳性克隆子的筛选:用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物 0mpl9_F:5'-tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3' 和引物 0mpl9_R:5'-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，其特征在于：采用布鲁氏菌Omp19外膜蛋白进行重组表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜志强，王建英，张雪峰，
申请(专利权)人：内蒙古科技大学，
类型：发明
国别省市：内蒙古;15