同时对多种核酸样本进行测序的方法技术

本发明专利技术公开了同时对多种核酸样本进行测序的方法，该方法包括：将多种核酸样本分别依次进行接头连接、第一PCR扩增、末端磷酸化和DNA连接；将多种DNA连接产物进行混合；将混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A；将3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头；将测序接头连接产物进行第二PCR扩增，以便获得多种核酸样本的混合测序文库；将混合测序文库进行测序；以及对所述测序结果进行分类，以便分别获得多种核酸样本各自的核酸序列。利用该方法能够同时对多种核酸样本进行测序，并且测序结果准确，可重复性好，成本低，效率高，对测序通量利用充分，该方法尤其适用于血液游离DNA样本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是测序
，具体地，本专利技术涉及。
技术介绍
以Illumina Hiseq系列为代表的第二代深度测序技术在近年来得到了长足发展，其通过对上百万条DNA短片段的同时的平行测序，使得在短时间内就能够完成每个碱基的测序，且相对于传统测序成本大幅度降低、准确度提高。但是，至今仍没有成本更低且准确度高的同时对多个核酸样本进行测序的方法。因而，目前仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种成本低、准确度高、重复性好的。根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤:将多种核酸样本分别进行接头连接，以便获得连接接头的核酸样本，其中，针对不同的核酸样本采用不同的接头；将所述连接接头的核酸样本分别进行第一PCR扩增，以便获得多种第一PCR扩增产物；将所述多种第一PCR扩增产物分别进行末端磷酸化，以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物；针对每一种核酸样本，分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接，以便获得多种DNA连接产物；将所述多种DNA连接产物进行混合，以便获得混合DNA连接产物；将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的连接产物；将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头，以便获得测序接头连接产物；将所述测序接头连接产物进行第二 PCR扩增，以便获得第二 PCR扩增产物，所述第二 PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库；将所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列，对所述测序结果进行分类，以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。专利技术人惊奇地发现，利用该方法能够同时对多种核酸样本进行测序，并且测序结果准确，可重复性好，成本低，效率高，对测序通量利用充分。此外，根据本专利技术的实施例，本专利技术的尤其适用于血液游离DNA样本，进而该方法能够有效用于产前诊断，通过同时对多种血液游离DNA样本进行测序，实现低成本测序、跨平台兼容、软件自动化，提高可以开展产前诊断的范围。 另外，根据本专利技术上述实施例的，还可以具有如下附加的技术特征:根据本专利技术的实施例，所述核酸样本来源于哺乳动物，优选人，更优选人的外周血。根据本专利技术的一些实施例，所述核酸为DNA或RNA。根据本专利技术的另一些实施例，所述核酸为游离DNA。根据本专利技术的实施例，在进行所述接头连接之前，进一步包括:将所述多种核酸样本分别进行末端修复。根据本专利技术的实施例，所述末端修复是利用Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶进行的。由此，末端修复效果好，效率高，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，利用T4DNA连接酶进行所述接头连接。由此，能够高效地连接接头，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，利用T4多核苷酸激酶进行所述末端磷酸化。由此，提高了接头连接的效率，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，利用PE接头和T4DNA连接酶进行所述DNA连接。由此，能够高效地实现DNA连接，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，在获得多种DNA连接产物之后，以及将所述多种DNA连接产物进行混合之前，进一步包括对所述多种DNA连接产物进行片段选择。根据本专利技术的一些实施例，通过切胶回收或磁珠捕获进行所述片段选择。由此，能够有效地实现片段选择，获得目的片段。根据本专利技术的实施例，利用Klenow(3’ _5’ exo-)进行所述3’端添加碱基A。由此，能够高效地实现3’端添加碱基A，有利于后续步骤的进行。根据本专利技术的实施例，通过二代测序平台进行所述测序。根据本专利技术的实施例，通过选自Illumina的His eq、GA系列测序仪、Life tech的1n系列测序仪和罗氏公司的454系列测序仪的至少一种进行所述测序，优选Illumina Miseq0由此，能够有效降低测序成本，并提高测序质量。根据本专利技术的实施例，所述测序接头连接产物的长度不大于测序仪的最长读长。由此，能够在保证测序准确度的前提下，充分利用测序仪的测序通量。根据本专利技术的实施例，进一步包括:对测序之前的各步骤的产物进行纯化回收。由此，能够有效提高各步骤产物的纯度，减少杂质干扰，有利于后续步骤的进行，从而能够提高混合测序文库的质量，最终提高测序的准确性。根据本专利技术的一些具体示例，通过磁珠法或PCR纯化试剂盒进行所述纯化回收。由此，能够有效提高纯化回收的效率，获得高纯度的纯化产物。此外，根据本专利技术的一些实施例，当核酸样本数多于接头数时，进一步包括:将所述核酸样本进行分组，以便使各组的核酸样本数不大于接头数；以及针对每一组核酸样本，分别进行各步骤。由此，利用较少的接头即可实现对数量众多的多种核酸样本的测序，从而既能够保证测序质量，提高测序效率，又能够有效降低测序成本。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。【附图说明】本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:图1显示了根据本专利技术一个实施例，本专利技术的的流程示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的测序接头连接产物的结构示意图。【具体实施方式】下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多种”的含义是两种或两种以上。如前所述，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种。根据本专利技术的实施例，参照图1，该方法包括以下步骤:SlOO:针对每一种核酸样本，分别依次进行接头连接、第一 PCR扩增、末端磷酸化和DNA连接，获得多种DNA连接产物具体地:首先，将多种核酸样本分别进行接头连接，以便获得连接接头的核酸样本，其中，针对不同的核酸样本采用不同的接头。由此，能够通过不同的接头对各核酸样本进行区分。其中，根据 本专利技术的实施例，所述核酸样本的来源不受特别限制。根据本专利技术的一些具体示例，所述核酸样本可以来源于哺乳动物，优选人，更优选人的外周血。由此，利用本专利技术的方法能够有效实现同时对多种核酸样本的测序。[0031 ] 根据本专利技术的实施例，所述核酸的种类不受特别限制，DNA和RNA均适用本专利技术的方法。根据本专利技术的一些实施例，所述核酸为DNA或RNA。根据本专利技术的另一些实施例，优选地所述核酸为游离DNA (即血液游离DNA)。由此，本专利技术的方法能够有效用于血液游离DNA样本的测序，进而能够有效用于产前诊断，并且基于通过该方法能够同时对多种孕妇外周血游离DNA样本进行测序，从而将该方法用于产前诊断时能够在保证诊断结果准确性的前提下，有效提高产前诊断的效率，降低诊断成本。此外，需要说明的是，在本文中所使用的术语“接头”是人造的序列，一般为18~20个碱基组成，通过互补的方式结合成双本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时对多种核酸样本进行测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：将多种核酸样本分别进行接头连接，以便获得连接接头的核酸样本，其中，针对不同的核酸样本采用不同的接头；将所述连接接头的核酸样本分别进行第一PCR扩增，以便获得多种第一PCR扩增产物；将所述多种第一PCR扩增产物分别进行末端磷酸化，以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物；针对每一种核酸样本，分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接，以便获得多种DNA连接产物；将所述多种DNA连接产物进行混合，以便获得混合DNA连接产物；将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的连接产物；将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头，以便获得测序接头连接产物；将所述测序接头连接产物进行第二PCR扩增，以便获得第二PCR扩增产物，所述第二PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库；将所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列，对所述测序结果进行分类，以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种同时对多种核酸样本进行测序的方法，其特征在于，包括以下步骤: 将多种核酸样本分别进行接头连接，以便获得连接接头的核酸样本，其中，针对不同的核酸样本采用不同的接头； 将所述连接接头的核酸样本分别进行第一 PCR扩增，以便获得多种第一 PCR扩增产物； 将所述多种第一 PCR扩增产物分别进行末端磷酸化，以便获得多种经过末端磷酸化的PCR扩增产物； 针对每一种核酸样本，分别将所述经过末端磷酸化的PCR扩增产物进行DNA连接，以便获得多种DNA连接产物； 将所述多种DNA连接产物进行混合，以便获得混合DNA连接产物； 将所述混合DNA连接产物进行3’末端添加碱基A，以便获得3’末端添加碱基A的连接产物； 将所述3’末端添加碱基A的连接产物连接测序接头，以便获得测序接头连接产物；将所述测序接头连接产物进行第二 PCR扩增，以便获得第二 PCR扩增产物，所述第二PCR扩增产物构成所述多种核酸样本的混合测序文库； 将所述混合测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及 基于所述测序结果中与所述接头相对应的序列，对所述测序结果进行分类，以便分别获得所述多种核酸样本各自的核酸序列。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸样本来源于哺乳动物，优选人，更优选人的外周血， 任选地，所述核酸为DNA或RNA， 任选地，所述核酸为游离DNA。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在进行所述接头连接之前，进一步包括: 将所述多种核酸样本分别进行末端修复， 任...

【专利技术属性】
技术研发人员：田埂，方建火，郎继东，张丽娜，
申请(专利权)人：田埂，
类型：发明
国别省市：