本发明专利技术公开了广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用。本发明专利技术提供了取代脲类除草剂的酰胺水解酶基因及其所推导的水解酶蛋白质。该基因全长为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸，是一个新的对取代脲类除草剂脲桥具有广谱水解作用的酰胺水解酶基因资源。利用该基因构建的工程菌株能高效表达取代脲类除草剂酰胺水解酶，能在24h内将30mg/L的N‑甲氧基‑N‑甲基取代脲类除草剂(利谷隆)和N,N‑二甲基取代脲类除草剂(敌草隆、绿麦隆、伏草隆)完全降解，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物上的取代脲类除草剂残留的去除，该基因可用于抗取代脲类除草剂转基因作物的培育。
【技术实现步骤摘要】
广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用
本专利技术属于应用环境微生物领域，涉及广谱取代脲类除草剂降解菌及酰胺水解酶基因和应用。
技术介绍
除草剂的使用虽然提高了农业的生产效率，但同时带来严重的环境问题和作物药害问题。取代脲类除草剂已经被商业化生产超过50年，成为了全世界最广泛使用的重要的除草剂之一。由于其广泛重复的使用以及相对较高的水溶性，在各种污染的生境和农副产品中经常被检测到，除草剂作物药害也时有发生。因此，取代脲类除草剂残留已经成为生态环境保护和作物药害解除急需解决的问题。微生物修复除草剂污染的方法是一种简单、高效、廉价和无二次污染的方法，比化学方法、物理方法修复农药污染具有更多优势。微生物修复除草剂残留污染的本质是微生物产生的酶对除草剂的降解作用，从微生物中提取的降解酶系来消除除草剂残留在国外已有成功的先例，降解酶的来源可以通过从降解菌中提取，也可以采用基因工程手段构建高效表达菌株来获得。广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的获得在取代脲类除草剂污染的修复领域有巨大的应用潜力。同时，转基因抗除草剂作物培育是杂草治理史上的一次重大变革。2012年全球种植1.7亿公顷的转基因农作物中具有除草剂抗性性状的超过80％。因此，将除草剂降解基因转入作物中，培育转基因抗除草剂作物新品种，具有十分重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供广谱取代脲类除草剂降解菌。本专利技术的另一目的是提供从该降解菌中克隆到的酰胺水解酶基因。本专利技术的又一目的是提供该菌株、基因或基因编码蛋白的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1。该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸，其氨基酸序列为：SEQIDNO.2。含所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的重组质粒。作为本专利技术的一种优选方式，酰胺水解酶基因片段与酶切好的pET-29a(+)进行酶连获得含广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的PET-29a(+)重组质粒。含本专利技术所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。作为本专利技术的一种优选方式，酶连好的含酰胺水解酶基因的pET-29a(+)重组质粒转化到表达宿主菌BL21(DE3)获得重组微生物BL21(DE3)。所述的广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因在去除农作物、土壤、水体的取代脲类除草剂残留方面的应用。所述的取代脲类除草剂优选自N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂、N,N-二甲基取代脲类除草剂；所述的N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂进一步优选利谷隆；所述的N,N-二甲基取代脲类除草剂进一步优选敌草隆、绿麦隆、伏草隆。本专利技术所述的酰胺水解酶蛋白质在去除农作物、土壤、水体的取代脲类除草剂残留方面的应用。所述的取代脲类除草剂优选自N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂、N,N-二甲基取代脲类除草剂；所述的N-甲氧基-N-甲基取代脲类除草剂进一步优选利谷隆；所述的N,N-二甲基取代脲类除草剂进一步优选敌草隆、绿麦隆、伏草隆。有益效果1.本专利技术利用细菌全基因组测序技术成功的从菌株LR2014-1(CCTCCNO：M2015236)中克隆出利谷隆酰胺水解酶基因。2.该基因全长(从起始密码子到终止密码子)为1377bp，G+C含量为63.5％，编码458个氨基酸。3.通过PCR技术扩增末端含BamHI和XhoI酶切位点的完整的利谷隆酰胺水解酶基因片段，将它连接到大肠杆菌高效表达载体pET-29a(+)(购自Novegen公司)的BamHI和XhoI酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(购自invitrogen公司)，进行IPTG诱导表达。4.本专利技术对利谷隆酰胺水解酶基因表达的产物，做了酶活性测定，能高效的降解利谷隆，对30mg/L的利谷隆在24h内能完全降解。5.本专利技术对利谷隆酰胺水解酶基因的表达产物进行了底物谱研究，发现该酰胺水解酶可以降解大多数的取代脲类除草剂，包括利谷隆、敌草隆、绿麦隆、伏草隆等，为广谱的取代脲除草剂酰胺水解酶。6.利用该基因构建的工程菌株能高效表达广谱取代脲除草剂酰胺水解酶，生产的酶制剂可用于土壤、水体和农作物残留的利谷隆的降解或去除。附图说明图1为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质及其编码基因来源的菌株LR2014-1在固体培养基上的菌落图和电镜图以及在加有利谷隆农药平板上产生的水解圈。图2为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶降解利谷隆的高效液相色谱图检测图，图A为利谷隆标准品的液相色谱检测图，图B为3,4-二氯苯胺标准品的液相色谱检测图；图C本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶粗酶液降解利谷隆的高效液相色谱图检测图。图3为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶基因功能验证的策略图。图4为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶基因在BL21(pET-29a(+))中高效表达实验方案图；图5为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶基因在表达宿主菌BL21(DE3)中表达的并纯化后的蛋白SDS-PAGE电泳图。图6为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质的最适温度及最适pH值的研究结果图。图7金属离子对本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质影响的研究结果图。图8为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解利谷隆的高效液相色谱图和质谱检测图。图9为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解敌草隆的高效液相色谱图和质谱检测图。图10为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解绿麦隆的高效液相色谱图和质谱检测图。图11为本专利技术广谱取代脲类除草剂水解酶蛋白质在标准酶活体系中降解伏草隆的高效液相色谱图和质谱检测图。生物材料保藏信息LR2014-1，分类命名为Diaphorobactersp.LR2014-1，保藏于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCCNO：M2015236，保藏日期为2015年04月15日，保藏地址为中国武汉武汉大学。具体实施方式实施例1菌株LR2014-1降解利谷隆的效果评估和代谢产物分析1.1种子液制备将菌株LR2014-1(CCTCCNO：M2015236)接入含30mg/L利谷隆的100mLLB培养基中，30℃、150rpm摇床培养，48h后6000rpm离心收集菌体，使用MM洗涤菌体两次，最后用10mLMM重悬，作为种子液备用。1.2菌株LR2014-1对除草剂利谷隆的降解将菌株LR2014-1按5％的接种量接至含有30mg/L利谷隆的100mLMM中，30℃、150rpm摇床培养，培养12h后，取3ml培养液用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后1ml甲醇复溶，用滤膜(孔径0.22μm)过滤，采用高效液相色谱进行检测。液相色谱检测条件：岛津RID-10A；C18反相柱；流动相：乙腈：水(体积比65/35)，流速：1ml·min-1，紫外检测器，波长210nm和250nm；进样量：20μl。实验结果表明所述菌株LR2014-1能够降解利谷隆，培养12h后，所述菌株对利谷隆的降解率高达80％以上。HPLC检测结果表明利谷隆被降解为3,4-二氯苯胺(图2)。实施例2利谷隆酰胺水解酶基因的克隆2.1细菌基本文档来自技高网...
【技术保护点】
广谱取代脲类除草剂酰胺水解酶基因，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
【技术特征摘要】
1.取代脲类除草剂酰胺水解酶基因，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.1。2.权利要求1所述的酰胺水解酶基因编码的酰胺水解酶蛋白质，其特征在于氨基酸序列为：SEQIDNO.2。3.含权利要求1所述的取代脲类除草剂酰胺水解酶基因的重组质粒。4.含权利要求3所述的重组质粒的重组微生物BL21(DE3)。5.权利要求1所述的取代脲类除草剂酰胺水解酶基因在去除土壤、水体或农作物的取代脲类除草剂残留方面的基因工程应用；所述的取代脲类除草...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋建东，张龙，陈凯，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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