本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用。所述方法包括PCR反应、PCR产物纯化、单碱基延伸、延伸产物纯化、质谱仪检测的步骤；所述试剂盒包括PCR反应试剂、纯化试剂及单碱基延伸反应试剂。本发明专利技术相比于现有技术具有灵敏度高、特异性强、简便安全、速度快、高通量、更节约时间等优点。
【技术实现步骤摘要】
质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用
本专利技术属于生物
，涉及一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法、试剂盒及其应用，具体而言是利用PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，选用Kras基因对血清中游离DNA进行检测的方法。
技术介绍
游离循环核酸是一种存在于人的体液中的细胞外游离状态核酸。游离循环DNA的分子大小在500bp~30kb之间。正常人外周血中游离DNA主要来自细胞核DNA和线粒体 DNA，其含量较少，而肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞。近年来，随着对游离核酸研究的不断深入，游离DNA的检测已经在疾病监控、胎儿产前诊断和肿瘤研究中取得众多进展。检测恶性肿瘤患者血液中游离DNA用于基因诊断已成为研究热点，且研究显示血液中游离DNA有可能成为一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。游离DNA是存在于血液、滑膜液等体液中的细胞外游离DNA。研究发现许多肿瘤患者游离DNA与正常人相比有很大差异。游离DNA检测避免了当前分子诊断需要采集癌组织作为标本来源的困难，是一种有潜力的肿瘤标志物。近年研究发现在外周血液中能够检测到早期肿瘤细胞逸出的突变DNA，成为良好的肿瘤诊断、治疗预后的生物标记。Kimura等(2006年)报道能够在循环血液中检测到Kras 突变，认为检测这些外周血液中的突变DNA，可以知道患者体内是否存在微小病灶、肿瘤手术后是否存在转移、靶向药物靶标位点的分子学特征等，从而作出相应治疗方案。因此，检测Kras基因的突变，还将有助于评价治疗效果，有助于对肿瘤发病风险进行预测，有助于对肿瘤转移进行早期诊断。由于血液中游离DNA的含量很低，通常每毫升仅为纳克水平，已经大大超出传统的溴化乙啶染色和紫外分光光度仪等实验室常用的DNA定量方法的检测范围。而荧光定量 PCR方法涉及到荧光染料，容易引起假阳性。 申请号为200910177851.2的中国专利技术申请文件提供了一种检测KRAS基因和/或 BRAF基因的核苷酸突变位点的方法，该方法在一定程度上提高了检测的灵敏度和准确度， 但是其检测速度仍不能满足现状的需求。所以本领域需要一种不仅具有高灵敏度和准确度，而且能真正提高速度的检测游离DNA的方法。
技术实现思路
本专利技术提供一种高灵敏度、准确的检测游离DNA的方法，以克服现有技术的不足。 具体是一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，该方法的技术原理为:利用联合PCR技术、 单碱基延伸技术和质谱检测技术，对血清中游离DNA进行检测；其中:在单碱基延伸过程中，对PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在突变处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与突变处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各突变处的基因型。本专利技术目的是提供一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括如下步骤:(1)PCR反应:游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13 密码子区域的PCR产物；所述PCR扩增是用序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物进行扩增；(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；(3)单碱基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一条或几条；(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化；以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。上述方案中优选的是，步骤(1)中所述突变的基因名12S、12R、12C、12D、12A、12V、 13D中的任一种或几种，所述12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D基因序列分别为AGT-GGC， CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-G^C，带下划线的为突变后的碱基。上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述引物I和引物2的5’端都增加3-15个保护碱基序列，以使PCR引物的分子量增大，从而避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果。上述任一方案中优选的是，所述引物I和引物2的5’端都增加的保护碱基序列为:ACGTTGGATG。上述任一方案中优`选的是，步骤(1)中所述PCR扩增是用dNTPs、MgCl2进行扩增， 所述 dNTPs 为 dATP、dTTP, dGTP、dCTP。上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述PCR扩增是用Taq酶进行扩增。上述任一方案中优选的是，步骤(1)中所述PCR扩增经变性、退火、延伸三个步骤； 所述变性温度为95°C，所述退火温度为56°C，所述延伸温度为72°C。上述任一方案中优选的是，所述变性时间为10秒，所述退火时间为10秒，所述延伸时间为30秒。上述任一方案中优选的是，步骤(2)中所述PCR产物纯化是利用SAP酶纯化。上述任一方案中优选的是，所述SAP酶纯化是先在温度为37°C下纯化45分钟，然后在温度为85°C下15分钟使SAP酶高温失活。上述任一方案中优选的是，步骤(3)中所述单碱基延伸经过变性、退火、延伸三个步骤，所述变性温度为94°C、退火温度为52°C、延伸温度为72°C。上述任一方案中优选的是，所述变性时间为5秒、退火时间为5秒、延伸时间为5秒。上述任一方案中优选的是，步骤(4)中所述延伸产物纯化是向延伸产物中加入纯化水和树脂，混匀后纯化。上述任一方案中优选的是，所述纯化时间为30分钟。上述任一方案中优选的是，步骤(5)中所述质谱仪检测是利用飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。上述任一方案中优选的是，所述飞行时间质谱仪包括激光器、真空系统、质量分析器、电子数据系统、系统状态检测卡、触摸屏电脑、样品室和数据处理系统。上述样品室的第一个作用是作为放取、承载靶板的工具，它能够确保靶板可以在短时间内方便的放取，并平稳的固定在底座上；第二个作用是辅助保持仪器真空度，防止飞行管中的真空环境被放取靶板的开放性的过程破坏；第三个作用是精确定位和靶板微距移动，通过微距步进电机的使用，可以使靶板进行微距移动以达到选择靶环上不同靶点的目的。上述任一方案中优选的是，所述激光器为氮气激光器、半导体激光器、光纤激光器中的任一种。上述任一方案中优选的是，所述光纤激光器是用掺稀土元素的玻璃光纤作为增益介质的激光器。光纤激光器拥有制造成本低及其光纤的可饶性所带来的小型化、集约化优势；它所采用的玻璃材料具有散热快，转换效率较高，激光阈值低的特点；而且光纤激光器的谐振腔内无光学镜片，具有免调节、免维护、高稳定性的优点；同时它还拥有很高的电光效率，综合电本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括以下步骤：?（1）PCR反应：游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13密码子区域的PCR产物；所述PCR扩增是用序列为SEQ?ID?No：1和SEQ?ID?No：2的PCR引物进行扩增；（2）PCR产物纯化：对步骤（1）得到的PCR产物进行纯化；（3）单碱基延伸：使用iPLEX?Pro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤（2）得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ?ID?No：3、SEQ?ID?No：4、SEQ?ID?No：5中的任一条或几条；（4）延伸产物纯化：对步骤（3）得到的延伸产物进行纯化；（5）质谱仪检测：将步骤（4）得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。
【技术特征摘要】
2013.11.06 CN 201310547278.61.一种质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，包括以下步骤:(1)PCR反应:游离DNA中Kras基因进行PCR扩增，得到含Kras基因12密码子和13 密码子区域的PCR产物；所述PCR扩增是用序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2的PCR引物进行扩增；(2)PCR产物纯化:对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化；(3)单碱基延伸:使用iPLEXPro酶、ddATPs、ddCTPs、ddTTPs和特异性的延伸引物，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的SNP位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对；所述特异性的延伸引物为SEQ ID No:3、SEQ ID No:4、SEQ ID No:5 中的任一条或几条；(4)延伸产物纯化:对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化；(5)质谱仪检测:将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行检测。2.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述 Kras 基因为 12S、12R、12C、12D、12A、12V、13D 中的任一种或几种，所述 12S、12R、12C、12D、 12A、12V、13D 基因序列分别为 AGT-GGC、CGT-GGC, TGT-GGC, GAT-GGC, GCT-GGC, GTT-GGC, GGT-GAC03.如权利要求1所述质谱仪鉴定血清中游离DNA的方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物I和...
【专利技术属性】
技术研发人员：张学记，马庆伟，张海燕，林燕，
申请(专利权)人：毅新兴业北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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