一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种在人的生物液体样本中检测游离的稀有肿瘤细胞的方法和试剂盒。具体地，本发明专利技术提供了一种通过检测来自于肿瘤患者的生物液体样本中有核细胞的葡萄糖摄取能力及白细胞标志物CD45的表达从而鉴定其中具有活性的肿瘤细胞的方法。本发明专利技术操作简单快速，且无需对于样本中肿瘤细胞进行预先富集，一方面极少损失肿瘤细胞，另一方面基于代谢功能的鉴定方法对于液体样本中游离肿瘤细胞的鉴定较常用的免疫荧光染色的方法更为准确。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物与医学检测领域。更具体地，本专利技术涉及人外周血或胸水样本中游离的稀有肿瘤细胞的检测方法和试剂盒。本专利技术提供了一种快速从人生物液体样本(如血液、胸水、心包积液，优选为肿瘤患者外周血或胸水样本)中检测具有活性的稀有肿瘤细胞方法和试剂盒。
技术介绍
人外周血中的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)是指从肿瘤病灶脱落并进入外周血循环的肿瘤细胞，它代表了肿瘤病灶的分子特征，并在一定条件下可发展为肿瘤转移性病灶，因此对血液中的CTC进行计数、分子检测以及体外培养越来越引起人们的重视。但是，CTC在血液中极其稀少，一毫升血液中含有50亿个红细胞，近一千万个白细胞，可却只有几个至几十个CTC，因此给检测带来了巨大的技术挑战。目前对CTC检测的基本策略是先富集再鉴定，以目前唯一获得美国FDA批准用于检测转移性乳腺癌、前列腺癌及结直肠癌患者外周血中CTC的CellSearch系统为例，它首先运用标记有针对EpCAM(上皮细胞标志物)抗体的磁性颗粒对癌症患者7.5毫升血液中CTC进行富集，然后通过免疫荧光染色的方法鉴定富集后的细胞中哪些是CTC，哪些是非特异性混入的白细胞，其标准为将DAPI(细胞核染料)阳性/CK(细胞角蛋白，上皮细胞标志物)阳性/CD45(白细胞标志物)阴性且符合一定形态学标准的细胞鉴定为CTC。其他针对CTC的检测方法基本沿用了类似的策略，即第一步对血液中的CTC先进行富集，其具体富集的原理与方法可能各不相同，有通过针对CTC表面抗原(如EpCAM)的特异性抗体进行正选富集的，其中抗体可负载于磁球或微流控芯片上捕获样本中的CTC，也有根据细胞大小进行正选富集，将一般尺寸较大的CTC从样本中分离出来，还有通过去除白细胞负选的方法进行富集的。为了获得较高的CTC捕获率以及纯度，这些方法往往繁琐复杂，而且富集之后与CTC一同被
分选出来的往往还有几千至几十万个白细胞，因此需要进一步的鉴定才能准确的检测到CTC。所以，富集之后第二步一般通过免疫染色来区分CTC与白细胞，所使用的标志物主要包括上皮标志物细胞角蛋白CK、白细胞标志物CD45与细胞核染料DAPI，将表达上皮标志物CK、不表达白细胞标志物CD45且有核的细胞鉴定为CTC并计数。但是，以CellSearch系统为代表的这一CTC检测方法存在若干缺陷。第一，CellSearch系统的富集方法灵敏度不高，检出率较低，在富集过程中损失了相当部分的CTC。事实上对于CTC的富集不仅操作繁琐复杂，而且在富集过程中会不可避免的损失数量不等的CTC。第二，基于EpCAM+/DAPI+/CK+/CD45-的肿瘤细胞鉴定方法严格来说并不准确，它并没有使用任何肿瘤特异性标志物，实际上鉴定的是上皮来源细胞而非肿瘤细胞。最新的研究表明在良性疾病患者，甚至健康人血液中也能检测到上皮来源的细胞，因此这种鉴定方法存在假阳性的可能。同时，研究发现肿瘤细胞在转移过程中发生的上皮间质转化(EMT)将导致CTC不表达或低表达上皮标志物，因此有可能被漏检。第三，由于上述的基于免疫荧光染色的CTC鉴定方法中使用了固定与细胞核染色，因此被免疫荧光染色后的CTC难以被进一步用于测序分析与体外培养，而测序是目前最重要针对肿瘤的分子检测手段。针对CTC的单细胞测序通过对驱动基因的测序能够进一步明确其肿瘤细胞属性以及发现可供靶向药物治疗的分子靶点，而固定与细胞核染色将干扰单细胞的基因组扩增，因而影响后续的测序。因此，应尽量保持细胞的活性以及鉴定CTC的步骤不包括固定等影响单细胞基因组扩增的步骤。第四，研究发现CTC具有很大的功能异质性，相当一部分CTC处于凋亡或坏死状态，只有一部分CTC具能够实现转移，而临床上需要真正关注的正是那一部分具有高度活力与转移潜能的CTC而不是全部的CTC。包括CellSearch在内的技术都无法从功能上鉴定CTC的恶性程度以及转移潜能。目前几乎所有的CTC检测方法都具有与CellSearch系统类似的缺陷，富集步骤繁琐复杂且损失CTC，而基于免疫荧光染色的CTC鉴定方法无法准确鉴定肿瘤细胞，且限制了后续基因测序分析与体外培养的进行。因此，目前缺乏快速、准确的鉴定血液或其他体液如胸水、心包积液样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，且该方法不影响后续对CTC的测序与体外培养。因此，本领域迫切需要开发能够在肿瘤患者外周血或胸水样本中快速、准
确鉴定具有高度活性与恶性程度的肿瘤细胞的技术，且这一技术不影响后续对所鉴定的肿瘤细胞进行测序或体外培养。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种快速、准确地检测肿瘤患者血液或胸水样本中游离的肿瘤细胞的方法和装置。根据以上的需要，本专利技术的创新点主要包括以下几项：第一、不使用富集步骤从而大大减少CTC的损失，这里的富集是指针对有核细胞的富集，对于血小板、无核的红细胞这些不会与CTC发生混淆的血液成分仍可去除；第二、通过简单、有效的方法快速在所有的有核细胞中鉴定肿瘤细胞，而正因为鉴定方法的简单快速才能确保可对大量细胞进行检测，使得不富集直接检测成为可能；第三、肿瘤细胞的检测方法不影响后续的测序与体外培养；第四、所有细胞均可寻址，因此能够方便准确的取出单个的肿瘤细胞进行测序。而本专利技术所采用的肿瘤细胞鉴定方法，即高葡萄糖摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45是肿瘤细胞所具有的普遍特征，不依赖于肿瘤细胞的尺寸、表面抗原表达情况等，因此是一种简单可靠的肿瘤细胞鉴定方法。因其简单快速，所以配合高速荧光成像系统能够对大量细胞进行快速检测，从而使得不对样本中的有核细胞进行富集成为可能。同时对葡萄糖摄取与CD45的检测不影响细胞活性，能够用于后续的单细胞基因组测序及体外培养等用途。细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到肿瘤细胞并取出。本专利技术的第一方面，提供了一种非诊断性地检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，所述方法包括步骤：(a)提供一外周血或胸水生物样本，所述的生物样本为通过选择性裂解除去红细胞的样本；(b)将步骤(a)中的样本与针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体共孵育，从而使样本中的白细胞表面标记针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体；(c)将步骤(b)中获得的标记有白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体的细胞样本分散于所述的微孔阵列芯片中，所述的芯片包括多个用于容纳细胞，且可以被寻址的微孔，且所述的微孔数与样本中的细胞数的比例为1:0.2-5，优选
为1:1-3；(d)用带有荧光标记的葡萄糖类似物与所述的分布于微孔阵列中的细胞进行共培养；(e)检测各个微孔中细胞的荧光标记的葡萄糖类似物摄取量以及CD45表达的荧光信号；和(f)将高摄取葡萄糖且不表达CD45的细胞鉴定为具有活性的肿瘤细胞，并记录该细胞所在微孔的坐标位置；且所述的步骤(a)中，所述的外周血或胸水生物样本为未经过有核细胞富集的样本。在另一优选例中，所述的人生物液体样本选自下组：血液、胸水、心包积液，更优选为肿瘤患者的外周血或胸水样本。在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞(CTC，Circulating Tumor Cell)，优选地为选自下组的肿瘤细胞：肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种非诊断性地检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一外周血或胸水生物样本，所述的生物样本为通过选择性裂解除去红细胞的样本；(b)将步骤(a)中的样本与针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体共孵育，从而使样本中的白细胞表面标记针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体；(c)将步骤(b)中获得的标记有白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体的细胞样本分散于所述的微孔阵列芯片中，所述的芯片包括多个用于容纳细胞，且可以被寻址的微孔，且所述的微孔数与样本中的细胞数的比例为1:0.2‑5，优选为1:1‑3；(d)用带有荧光标记的葡萄糖类似物与所述的分布于微孔阵列中的细胞进行共培养；(e)检测各个微孔中细胞的荧光标记的葡萄糖类似物摄取量以及CD45表达的荧光信号；和(f)将高摄取葡萄糖且不表达CD45的细胞鉴定为具有活性的肿瘤细胞，并记录该细胞所在微孔的坐标位置；且所述的步骤(a)中，所述的外周血或胸水生物样本为未经过有核细胞富集的样本。

【技术特征摘要】
1.一种非诊断性地检测人生物液体样本中游离的稀有肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括步骤：(a)提供一外周血或胸水生物样本，所述的生物样本为通过选择性裂解除去红细胞的样本；(b)将步骤(a)中的样本与针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体共孵育，从而使样本中的白细胞表面标记针对白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体；(c)将步骤(b)中获得的标记有白细胞表面抗原CD45的荧光修饰抗体的细胞样本分散于所述的微孔阵列芯片中，所述的芯片包括多个用于容纳细胞，且可以被寻址的微孔，且所述的微孔数与样本中的细胞数的比例为1:0.2-5，优选为1:1-3；(d)用带有荧光标记的葡萄糖类似物与所述的分布于微孔阵列中的细胞进行共培养；(e)检测各个微孔中细胞的荧光标记的葡萄糖类似物摄取量以及CD45表达的荧光信号；和(f)将高摄取葡萄糖且不表达CD45的细胞鉴定为具有活性的肿瘤细胞，并记录该细胞所在微孔的坐标位置；且所述的步骤(a)中，所述的外周血或胸水生物样本为未经过有核细胞富集的样本。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的芯片上微孔的数目为5万至50万个，优选为15-25万个。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)和(b)之间，还包括步骤：通过标记CD45抗体的免疫磁球除去白细胞以减少细胞数目。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：施奇惠，陆舜，邓宇亮，汤寅，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31