一种检测接受基因治疗的受治者血清中有复制能力的病毒的方法技术

本发明专利技术提供一种检测接受基因治疗的受治者血清中是否存在有复制能力的病毒的方法，该方法包括用特异性抗原检测血清中的抗逆转录病毒的抗体的步骤。该抗原的基因不存在于用于基因治疗的病毒载体中，而仅存在于该病毒载体来源的病毒基因组中，并且该抗原优选地选自鼠白血病病毒的部分的Ｇａｇ和部分的Ｅｎｖ蛋白。同时还提供了其氨基酸序列包括ＳＥＱＩＤＮＯ：２或ＳＥＱＩＤＮＯ：６的序列的抗原，由于其特异性和灵敏度，它们在基于免疫反应的ＲＣＲ检测中用处很大。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及一种通过测定病人血清中是否存在抗体来检测基因治疗过程中是否存在有复制能力的病毒(RCV)的方法，该方法是利用逆转录病毒Gag或Env蛋白的特定抗原部分来实现的，基因治疗中所使用的病毒载体来源于该逆转录病毒。基因治疗是一种医学干涉方法，通过将正常基因导入到病人细胞中，来治疗由基因突变或代谢紊乱引起的疾病。毫无疑问，生物和遗传工程技术在将来会继续快速发展，所以预计基因治疗会成为一种治疗目前不能治愈或难以治愈的疾病的最有效的方法。基因治疗的最重要部分是载体系统，它用来将用于治疗的基因导入生物体。目前广泛使用的病毒载体包括逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒。逆转录病毒载体是最常用的，目前用于约50％的临床试验中。大多数逆转录病毒载体来源于鼠白血病病毒(MLV)。虽然病毒载体是基因治疗的具代表性的选择，但在它们的应用中有一定的安全性问题。治疗性的病毒载体通过遗传工程设计为复制缺陷型，但通过载体和病人中与病毒基因组类似的核苷酸序列之间的同源重组，可以产生有复制能力的病毒(RCV)。这在用病毒载体进行基因治疗中存在严重危险。因此，为确保基因治疗的安全性，已经发展了几种方法来检测RCV。美国食品和药品管理局(FDA)指南规定，不仅要在重组病毒的产生阶段筛查是否有具有复制能力的逆转录病毒(RCR)存在，而且需在对病人给药病毒载体后进行定期筛查。应该在两个阶段检测RCR是否存在。第一个阶段是在病毒载体从生产者细胞系的产生阶段或在用逆转录病毒载体体外转导靶细胞之前。第二个阶段是在将进行遗传工程操作的细胞给药受治者后，其中细胞含有通过逆转录病毒导入的用于治疗的基因。典型的做法是10-20个受治者参与I期的临床试验，以一年三次的频率监测RCR是否存在。因此在该过程中耗费了大量的人力，时间和物力。已经有几种方法用于RCR的检测，包括用Mus dunni细胞进行检测，逆转录酶检测和聚合酶链式反应(PCR)。用Mus dunni细胞检测RCR如下所述。产病毒的细胞或含病毒的培养上清与含标记基因(如潮霉素，LacZ基因)的Mus dunni细胞共培养。从该共培养物中获得的上清用来感染适当的靶细胞，通过标记基因的表达监测病毒的存在(Forestell等，J Virol Methods 60171-178，1996)。该方法基于以下原理含有标记基因的RCR仅能通过具有包装序列而不含有其他病毒序列的逆转录病毒与不含有包装序列的Mus dunni细胞之间进行重组而产生。Mus dunni细胞也用于S+L-病灶(focus)检测(Haapala DK等J Virol.53827-833，1985)。RCR可通过Mus dunni细胞与产病毒细胞或从产病毒细胞获得的上清共培养后病灶的形成来进行检测。这些方法要花费多于一个月的时间，因为需要几轮上清或产病毒细胞与Mus dunni细胞的共培养以增加RCR的滴度。另外，S+L-检测本身也要另外花费5-7天。逆转录酶检测方法需要根据以下假设进行，只有通过重组产生的RCR具有逆转录酶活性，而用于治疗的逆转录病毒没有。PCR方法对RCR的检测是通过一对引物进行的，其中一个引物序列存在于逆转录病毒载体上，而另一个存在于原始病毒上，但不存在于逆转录病毒载体上。这是临床试验中最常用的一个方法，但其自身存在重现性低的问题(Long等，Human Gene Ther.91165-1172，1998；Otto等，Human Gene Ther.5567-575，1994)。上述方法都需要耗费大量的时间和劳力，而且受低重现性和灵敏度的问题的困扰。因此，已经进行研究以发展更为经济的方法，使其需要更短的时间和更少的样品，但是仍能保持高的灵敏度。已报道的一种此类的研究是通过ELISA检测是否产生抗MLV的抗体来检测RCR(Martineau等，Human Gene Ther.81231-1241，1997)。然而，由于整个MLV病毒被作为一个抗原，该方法的特异性和灵敏度仍不能令人满意。因此，需要生产具有高特异性和灵敏度的抗原来解决基于抗原-抗体相互作用进行RCR测定中抗原的特异性，灵敏度及其导致的使用上受限的问题，为了克服原有RCR检测方法中的问题，本专利技术人开发了一种高通量的RCR检测方法，它可以在逆转录病毒基因治疗后，使用从MLV衍生的特异抗原与病人的血清反应，从而很容易的筛查抗体的产生。该方法基于以下发现Gag或Env蛋白的特定片段具有RCR检测所需的特异性和灵敏度水平。本专利技术的进一步的目的是提供一种高灵敏度和经济的方法，可以高效地并用最少量的样品来检测受治者中RCR的产生。本专利技术更进一步的目的是提供一种通过病人血清与从MLV的Gag或Env衍生的抗原反应来检测RCR的方法，该方法是通过检测受治者中抗RCR的免疫反应所产生的抗体是否存在来进行的。图2表示重组质粒的构建的示意图，其中编码病毒蛋白的相应DNA片段插入到pMAL-c2载体中，以使MLV Gag的p30(CA)或Env的p15E(TM)可以作为麦芽糖结合蛋白(MBP)融合蛋白而被表达。图3表示重组质粒的构建的示意图，其中相应的编码DNA插入到pET-17b或pET-3a载体中，以使它们可以表达MLV Env的CA，TM或gp70(SU-1)用来作为T7标记的蛋白。图4a为SDS-PAGE照片，所示的是IPTG诱导前后MLV Gag(CA)蛋白在大肠杆菌中的表达水平。泳道1对照(IPTG诱导的pMAL-c2)泳道2和3IPTG诱导前后的MBP-CA(70kDa)泳道4和5IPTG诱导前后的T7-CA(31kDa)图4b为SDS-PAGE照片，所示的是IPTG诱导前后MLV Env(TM和SU-1)蛋白在大肠杆菌中的表达水平。泳道1对照(IPTG诱导的pMAL-c2)泳道2和3IPTG诱导前后的MBP-TM(57kDa)泳道4和5IPTG诱导前后的T7-TM(17kDa)泳道6和7IPTG诱导前后的T7-SU-1(24kDa)图5为凝胶照片，所示的为收获在大肠杆菌中产生的抗原蛋白后经柱层析的纯化结果(MBP融合蛋白用直链淀粉树脂柱，T7-标记的蛋白用Sepharose柱)。泳道1CA，其中MBP部分用蛋白酶因子Xa除去泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5.T7-SU-1图6a所示的为显示Western印迹的结果的照片，其中从pMAL-c2，pET-17b或pET-3a中表达的重组蛋白CA，TM和SU-1与兔抗-CA血清反应。泳道1CA泳道2T7-CA 泳道3MBP-TM泳道4T7-TM 泳道5T7-SU-1图6b所示的为显示Western印迹的结果的照片，其中从pET-17b或pET-3a中表达的重组蛋白CA，TM和SU-1与小鼠抗-MLV血清反应。泳道1T7-CA泳道2T7-TM 泳道3T7-SU-1图7a所示的为进行ELISA反应后T7-CA以S/CO(样品吸收值与临界值(cutoff value)的比)表示的特异性的图，其中兔抗-CA血清作为阳性样品，而正常兔血清作为阴性对照。图7b所示的为进行ELISA反应后T7-SU-1以S/CO(样品吸收值与临界值的比)表示的特异性的图，其中小鼠抗-MLV血清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测接受使用病毒载体的基因治疗的受治者中有复制能力的病毒的方法，该方法包括受治者的血清与一种抗原蛋白进行反应，该蛋白是由不存在于病毒载体上，而存在于该病毒载体所来源的病毒基因组中的基因所编码的；并在受治者的血清中检测抗体蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：金善荣，朴银珍，罗英顺，柳承信，
申请(专利权)人：迪吉株式会社，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]