本发明专利技术涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。本发明专利技术还涉及该多重表位融合抗原的制备方法，及采用酶联免疫吸附法检测猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体的试剂盒。本发明专利技术制备的多重表位融合抗原纯度高，稳定性好，且制备工艺简单，成产成本低；所述试剂盒的检测准确性好，灵敏度高，安全性强。
【技术实现步骤摘要】
检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原及试剂盒
本专利技术涉及一种采用酶联免疫吸附法检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原及试剂盒。
技术介绍
猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)最早爆发于1987年的美国，其后很快影响到周边多个国家。1991年，此病蔓延登陆欧洲，荷兰、英国、法国、德国等西欧多国均深受其害。同年，荷兰科学家首次分离出其致病病毒猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)，命名为Lelystad病毒(LV)。1996年中国农业科学院哈尔滨兽医研究所首次从国内疑似病例血清中分离发现猪繁殖与呼吸综合症病毒，确认了此病在国内的发生和流行。猪繁殖与呼吸综合症是一种免疫抑制病，常常继发其他病原感染，其主要特症为严重的种猪繁殖障碍及较高的新生仔猪死亡率，此外还伴有，各年龄段猪的呼吸道疾病以及育肥猪的流感样症状。令人担忧的是，2006年夏季，中国中南部爆发了高致病型猪繁殖与呼吸综合症，之后蔓延到全国各个省市。高致病型猪繁殖与呼吸综合症的特点是能使不同年龄和不同品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率低。2007年，国内共有26个省份发生了高致病型猪繁殖与呼吸综合症，发病猪数量达30多万头，许多发病猪场的死淘率甚至达到100%。直至今日，疫病形势依然严峻，高致病型猪繁殖与呼吸综合症病毒已经成为猪的三大致死性病原之首，严重地影响了国内畜牧业生产。由于目前针对猪繁殖与呼吸综合症，尤其是高致病性PRRS还没有有效的治疗手段，所以及时、正确的诊断，是预报疫情、控制流行态势、防止疫病爆发的首要环节。迄今，PRRSV的检测方法主要包括:(I)采用PCR、原位核酸杂交、间接免疫荧光试验、间接免疫过氧化物酶试验等直接检测病料中的PCV-2和PRRS病毒核酸或抗原。但分子生物学检测操作复杂繁琐，对仪器设备、实验室条件、以及实验人员的技术要求高，检测成本亦相应增加，因此难以在基层单位大规模开展；而PRRSV具有抗原变异性的特点，也使得传统的单一抗原检测难以达到预期目的。(2)采用酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光抗体技术、免疫过氧化物酶单层试验等，检测猪血清中的抗PRRSV抗体。其中，ELISA已成为诊断PRRS最常用的方法。因为方法相对更为简单、稳定，对实验室及仪器设备的要求相对较低，易于实现高通量检测，是适于在基层单位推广的检测方法。自以Albina E.等于1992年首次用全病抗原建立ELISA方法用于检测抗PRRSV抗体以来，国内外已建立了多种以全病毒抗原为基础的ELISA方法，但通过细胞培养制备全病毒抗原存在费时、费力、成本高等不足，因此利用基因工程技术表达的重组抗原代替全病毒抗原是当今检测PRRSV的ELISA诊断方法研究的新热点。猪繁殖与呼吸综合症病毒为有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子直径50~65nm,核衣壳25~35nm,表面有明显的纤突,核衣壳呈立体对称的二十面体。该病毒属于套式病毒目(Nidovirales),动脉炎病毒科(Arterivirus)。猪繁殖与呼吸综合症病毒基因组全长约15.4kb,包括9个开放的阅读框架(Open Reading Frame, ORF),分别编码病毒复制所需要的酶(ORFla和ORFlb)和7个结构蛋白(0RF2a、0RF2b、0RF3~0RF7)。ORFla和ORFlb占基因组全长的3/4，编码的多聚蛋白ppla和pplab最终可水解为14个非结构蛋白(Nonstructural Protein, NSP)。这些NSP编码病毒RNA复制酶，是病毒产生的唯一的非结构性蛋白，参与病毒复制。按照欧洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒Lelystad株各非结构蛋白划分，Nsp7的起止位置为Ser2083~Glu2351。北美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒VR-2332株Nsp7的起止位置为Ser2200~Glu2458氨基酸。我国流行的猪繁殖与呼吸综合症病毒主要是北美洲型，主要为高致病性HuM株，由于HuM株较VR-2332株在Nsp2处存在30个氨基酸的缺失，所以HuM株Nsp7的起止位置为Ser2170~Glu2428。Nsp7共259个氨基酸，由777个碱基编码。研究显示Nsp7可诱导机体产生高水平的抗体，并能维持较长时间，说明Nsp7与机体免疫应答关系密切。0RF5编码主要的囊膜糖蛋白GP5，0RF2~0RF4分别编码次要结构蛋白GP2a、GP2b、GP3和GP4，GP5与0RF6编码的基质蛋白M形成二聚体，核衣壳蛋白(N蛋白)由0RF7编码。其中，N蛋白在病毒粒子中含量较高，是病毒的优势结构蛋白，约占病毒蛋白总量的20%~40%，同时抗原性最强且具有较好的保守性。猪繁殖与呼吸综合症病毒感染后机体首先产生的是针对N蛋白抗体，并且在体内持续时间最长，因而该蛋白已被作为检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的诊断抗原。 猪繁殖与呼吸综合症病毒的基因结构和抗原性比较复杂，并且具有抗原变异性的特点，使得单一抗原检测或通过单一抗原检测抗体均难以达到理想的灵敏度。全病毒作为包被抗原的优点是抗原制作方法比较简单，缺点是病毒纯化工艺复杂，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，有散毒隐患等。使用完整的病毒颗粒作为标准抗原虽然可具备理想的灵敏度，抗原制作方法也比较简单，但是需要进行病毒培养、灭活、以及灭活后的验证等复杂工艺，费时、费力、成本高，全病毒抗原建立的ELISA检测时有较强的背景反应和非特异性反应，以及不同批次差异较大，具有潜在病毒传播风险的隐患等，这些缺点使得该方法并不适合产业化开发；此外，完整的病毒颗粒作为抗原检测抗体，还容易出现假阳性结果。利用基因工程技术制备重组抗原代替全病毒抗原进行ELISA检测，可避免使用全病毒抗原检测的不足，其优点在于目的蛋白的反应特异性高，且一旦技术路线成熟，可大量稳定的制备。构建多重表位融合抗原是目前检测猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体最为理想的策略。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原(Multiple-epitope fusion antigen, MEFA)0本专利技术所提供的多重表位融合抗原，命名为NSP7-N1，具有序列表中SEQ IDNQ:1的氨基酸残基序列。序列表中的SEQ ID No:1由301个氨基酸残基组成，氨基(N)端第I个氨基酸残基为起始氨基酸甲硫氨酸(M);第2~260位为猪繁殖与呼吸综合症病毒基因中ORFla部分核苷酸残基序列编码的非结构蛋白7 (Nonstructural Protein7, NSP7)氨基酸序列；第261~265位柔性氨基酸连接序列(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser);第266~301位为0RF7部分核苷酸残基序列编码的N蛋白部分氨基酸残基序列。编码上述多重表位融合抗原的核苷酸序列也属于本专利技术的保护范围，具有序列表中SEQ ID No:2的核苷酸序列。序列表中的SEQ ID No:2由903个核苷酸碱基组成，其编码序列为:自5’端第I~3核苷酸编码氨基端第I位的甲硫氨酸；第4~780位核苷酸编码具有序列表SEQ ID NQ:1中第2~260位的NSP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种检测猪繁殖与呼吸综合症病毒血清抗体的多重表位融合抗原，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述的多重表位融合抗原，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。3.—种重组表达载体，其特征在于，含有权利要求2所述的核苷酸序列基因片段。4.一种宿主菌，其特征在于，具有如权利要求3所述的重组表达载体。5.一种制备权利要求1所述的多重表位融合抗原的方法，其特征在于，包含以下步骤: 1)克隆或合成多重表位融合抗原的基因序列； 2)酶切克隆的多重表位融合抗原的基因序列，连接经酶切的表达载体，构建多重表位融合抗原的重组表达载体； 3)将重组表达载体导入宿主菌，表达多重表位融合抗原融合蛋白； 4)纯化所述融合蛋白，获得所述多重表位融合抗原。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)需加入IPTG诱导剂，所加入IPTG的浓度...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡川闽，梁文斌，陈安，陈亨宇，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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