简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及试剂盒技术

根据本发明专利技术，能够适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因检测领域，具体涉及一种可适用于石蜡包埋样本等低质量样本 的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法。
技术介绍
DNA甲基化是基因组DNA的一种最常见的表观遗传修饰，大量研究表明DNA甲基 化修饰对于维持正常细胞功能、传递基因组遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生等起着 至关重要的作用。伴随着高通量测序的诞生，对DNA甲基化的研究越来越深入，作为DNA 甲基化检测的金标准全基因组重亚硫酸盐测序WGBS或BS-Seq(Whole genome bisulfate sequencing)，能够对全基因组DNA甲基化进行分析，并且具备了单碱基水平的检测灵敏 度。然而，正是由于BS-Seq能够对全基因组甲基化检测，也导致了测序深度高、测序费用高 等弊端。 2005 年AlexanderMeissner等在NucleicAcidsResearch首次提出简化的 表观重亚硫酸氢盐测序技术（RRBS，ReducedRepresentationBisulfiteSequencing)，该 方法通过MspI酶切富集启动子及CpG岛区域，并进行Bisulfite测序，同时实现CpG位点 的单碱基精度检测的高分辨率和测序数据的高利用率。RRBS作为一种高性价比的甲基化研 究方法，可以实现多个样本的比对基因组分析，在大规模临床样本的研究中具有广泛的应 用前景。 目前，RRBS测序技术主要用于人和小鼠，需要2-5ug基因组DNA起始构建文库。传 统的RRBS文库构建方法如下： (1)gDNA酶切：2 ~5μg基因组DNA起始量，采用MspI酶切gDNA，QIA-quickPCR PurificationKit过膜纯化； (2)末端修复：以dNTP为单核苷酸来源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和 Klenow片段对酶切后的粘性末端修复成平末端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯 化； (3)加"A"：以dATP为单核苷酸来源，采用Klenow片段（3'-5'ex〇-)为平末端3' 端加A，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化； (4)加"甲基化接头":采用T4DNA连接酶将带T的甲基化接头连接在含A的DNA 片段两端，QIA-quickPCRPurificationKit过膜纯化； (5)片段筛选：采用琼脂糖凝胶电泳回收150-325bp范围内的片段，QIA-quick GelExtractionKit进行胶纯化回收； (6)重亚硫酸氢盐处理：加入一定比例λ-DNA至胶回收产物作为对照，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit对胶回收产物进行Bisulfite反应； (7)PCR扩增：米用ΚΑΡΑHiFiHotStartUracil+ReadyMix对Bisulfite产物进 行PCR扩增，扩增产物Ampure磁珠纯化，文库构建完成； (8)文库质控：对文库进行2100峰图和QPCR质控，合格后高通量测序； (9)上机测序：根据需求选择测序策略和测序数据量。 RRBS测序技术的高性价比赢得了科研工作者的青睐，特别在多样本分析方面得到 广泛的应用，取得了较好的成效。然而，在实际应用过程中，RRBS也显示出一定的局限性， 存在的主要问题是： (1)对于石蜡包埋样本或其他低质量样本，数据浪费严重，数据利用率低； (2)RRBS建库一般要求起始样本的gDNA量为2~5μg，这使得珍贵的（一般而言 都是少量的）临床样本，很难达到建库起始量的要求。 参考文献 Li, N. , et al. , Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology. Methods. 2010. 52(3):p. 203-12. Alexander Meissner, Andreas Gnirke, George W. Bell, et al. Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 2005, 33(18):5868-5877.
技术实现思路
鉴于上述现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种能够适用于石蜡包 埋样本等低质量样本的、简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法及建库试剂盒。 本专利技术人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过在末端修复步骤中使 用dCTP、dGTP与dATP的适当比例的混合物代替传统的dNTP提供单脱氧核糖核苷酸、且将 末端修复步骤与加A步骤合并进行，可是实现适用于石蜡包埋样本等低质量样本的、简化 的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，从而完成了本专利技术。 即，本专利技术包括：1.-种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括： 步骤A:用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物； 步骤B:将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其 中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单脱氧核糖核苷酸，该混合物中 dCTP:dGTP:dATP的摩尔比为1:1:5~1:1:20，且该混合物中不包含dTTP; 步骤C:将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片 段； 步骤D:将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢 盐处理产物； 步骤E:所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； 步骤F:将所述PCR扩增产物进行片段筛选。 2.根据项1所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA的量为50~500ng。 3.根据项1或2所述的方法，其中，所述步骤A中的基因组DNA来自于低质量样 本。 4.根据项3所述的方法，其中，所述低质量样本是石蜡包埋样本。5.根据项1~4中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中的所述混合物中，dCTP: dGTP:dATP的摩尔比为 1:1:9 ~1:1:11。 6.根据项1~5中任一项所述的方法，其中，所述步骤B中采用包含所述酶切产 物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反应缓冲液的反应体系，进行末端修 复及3'端加A; 反应条件为30~50°C、0. 5~12小时。 7.根据项1~6中任一项所述的方法，其中，所述步骤C中采用包含所述3'端加 A的DNA片段、连接反应缓冲液、甲基化接头以及T4DNA连接酶的反应体系，进行加甲基化 接头； 反应条件为10~30°C、0. 5~5小时。 8.根据项1~7中任一项所述的方法，其中，在所述步骤A与步骤B之间、步骤B 与步骤C之间、和/或步骤C与步骤D之间任选还包括产物纯化步骤。 9. -种用于构建简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的试剂盒，其用于实施项 1~8中任一项所述的方法，其包括： 用于对所述酶切产物进行末端修复的试剂，该试剂包括dCTP、dGTP与dATP的混合 物，该混合物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种简化的表观重亚硫酸氢盐测序用文库的构建方法，该方法包括：步骤A：用MspI限制性内切酶处理基因组DNA，得到酶切产物；步骤B：将所述酶切产物进行末端修复及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其中，所述末端修复中使用dCTP、dGTP与dATP的混合物提供单核苷酸，该混合物中dCTP：dGTP：dATP的摩尔比为1:1:5～1:1:20，且该混合物中不包含dTTP；步骤C：将所述3'端加A的DNA片段加甲基化接头，得到加甲基化接头的DNA片段；步骤D：将所述加甲基化接头的DNA片段进行重亚硫酸氢盐处理，得到重亚硫酸氢盐处理产物；步骤E：所述重亚硫酸氢盐处理产物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；步骤F：将所述PCR扩增产物进行片段筛选。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：洪燕，徐护朝，王晓雯，赵红梅，玄兆伶，李大为，梁峻彬，陈重建，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11