一种重金属毒性技术领域的基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法，利用重金属铜可以通过取代NOS二聚体中的锌离子和钙离子，使NOS二聚体解聚，NO合成量下降，NOS的mRNA表达出现反馈性的上调；另一方面，NOS二聚体的解聚伴随着NOS的单体数量上升，细胞内活性氧含量上升，细胞翻译起始因子磷酸化，蛋白合成停止，最终导致细胞凋亡的毒性机制，将一氧化氮合成酶NOS用于重金属铜细胞毒性的检测，为重金属污染的生物安全性评估和治疗重金属中毒及其相关疾病的防治提供新的解决方案。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种重金属毒性
的方法，具体是一种基于一氧化氮合成酶NOS信号通路介导的重金属铜细胞毒性的检测方法。
技术介绍
重金属铜是生物体内必需的一种微量元素，是多种酶的辅助因子，参与生物系统内的电子转移。同时，研究表明，铜离子暴露后，产生大量活性氧，导致乳腺癌上皮细胞凋亡。在神经细胞中，铜暴露导致的细胞凋亡和细胞内NO合成量上升有关。一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)是一类同功酶,是生物体内唯--类专一11"生的以L-精氨酸(L - Arginine)为底物,利用氧气生成一氧化氮(NO)的酶。NO是一种可溶性气体，作为信号分子，参与体内众多的生理和病理过程，在体内担任重要的生理调节作用。NOS单体不具备催化产生NO的活性，而与细胞内的活性氧积聚有关。有报道表明NO参与氧化胁迫促使细胞凋亡。但重金属铜的具体毒性机制，尤其是与信号传导相关的分子机理尚不完全清楚。因此，在信号通路层面，通过重金属铜对NOS信号通路的作用机制进行毒理研究，阐明铜的致毒机理，对重金属污染的毒性检测、生物安全性评估和治疗重金属中毒及其相关疾病就显得尤为重要。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种基于一氧化氮合成酶NOS的重金属铜细胞毒性的检测方法，利用重金属铜可以通过取代NOS 二聚体中的锌离子和钙离子，使NOS 二聚体解聚，NO合成量下降，NOS的mRNA表达出现反馈性的上调、以及NOS 二聚体的解聚伴随着NOS单体数量的上升，细胞内活性氧含量上升，细胞翻译起始因子磷酸化，蛋白合成停止，最终导致细胞活性下降的毒性机制，建立NO合成量的下降与细胞活性降低之间的信号通路关联性，从而通过直接测定NO合成量的降低百分比来用于进行重金属铜细胞毒性的快速检测。本专利技术是通过以下技术方案实现的:本专利技术涉及一种一氧化氮合成酶NOS的应用，利用重金属铜能够使其二聚体解聚的特性，将其用于重金属铜细胞毒性的检测。所述的细胞毒性是指:由于重金属铜导致的细胞活性下降。所述的重金属铜细胞毒性的检测，包括以下步骤:I)模式细胞的培养，具体为:人乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清的普通含酚红DiffiM培养基在37°C、5% CO2培养箱中培养。实验前细胞接种于35mm培养皿，24h，贴壁。2)使用步骤I的模式细胞进行产物NO的检测，具体为:lmM重金属铜暴露30min后，裂解细胞，1000rpm, 4°C离心5min，取各管上清液50 μ L于96孔板，一氧化氮检测试剂盒检测产物NO，540nm测定吸光度，根据标准曲线计算细胞内NO含量。3)根据步骤2的结果进行细胞内锌离子和钙离子的检测，具体为:lmM重金属铜暴露30min后，Ca2+指示剂Fluo -3/AM孵育40min，检测荧光信号，激发波长:488nm，发射波长:525nm ；50 μ M TSQ探针孵育30min，检测荧光信号，激发波长:334nm，发射波长:485nm。4)根据步骤2的结果进行NOS的mRNA表达检测，具体步骤包括:4.1) ImM重金属铜暴露后，用高纯总RNA快速提取试剂盒提暴露后细胞总RNA ；4.2)取500ng总RNA，用反转录试剂盒，37°C反应15min，再85°C 5s使反转录酶失活；4.3)实时定量PCR定量，用2 - Δ Δ Ct方法分析基因的相对表达量。基因扩增的特异性由熔解曲线保证，PCR反应条件为95°C预变性30s，PCR循环如下:95°C变性5s，60°C延伸34s，40个循环。5)根据步骤4的结果进行NOS的蛋白表达及细胞翻译起始因子磷酸化表达的检测，具体为=ImM重金属铜以及ImM重金属铜和25mM LNAC共处理后，收集细胞，完全裂解细胞，12000rpm，4°C，离心3min。吸取上层清液，测蛋白浓度。上样，电泳，200V，跑35min ;转膜，150V, 50min ;封闭 30min ;一抗(nNOS, eNOS, iNOS, β - actin, p - elF2 α )，4°C，摇床孵育过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育30min ;显影，成像。6)根据步骤5的结果进行细胞内活性氧含量的检测，具体为:lmM重金属铜，ImM重金属铜和1mM L - Arg, ImM重金属铜和25mM LNAC共处理后，1mM DHR, 37°C孵育5min，检测突光信号，激发波长:488nm,发射波长:525nm。7)根据步骤6的结果进行细胞活性检测，具体为:ImM重金属铜，ImM重金属铜和1mM L -Arg, ImM重金属铜和25mM LNAC共处理后，每孔加20 μ L噻唑蓝溶液(5mg/mL)。孵育4h，弃掉各孔中溶液，每孔加入150 μ L 二甲基亚砜。振荡lOmin，测定吸光度(490nm)。吸光度与细胞活性成正比。8)根据步骤1-7实现重金属铜作用下NO合成量的下降与细胞活性降低之间具有信号通路的关联性，从而按照重金属铜作用下，30分钟时刻NO合成量的下降百分比作为重金属铜细胞毒性的检测结果。【附图说明】图1为ImM, I μ M，InM氯化铜暴露30min，细胞内NO含量变化示意图；图中:星号(*)，(**)表明显著性差异(ρ〈0.05，ρ〈0.01);结果显示:ImM氯化铜暴露30min，细胞内NO含量明显下降，与对照组相比有显著差异。图2为ImM氯化铜暴露10、20、30min，细胞内钙离子和锌离子的含量变化示意图；图中:星号(*)，(**)表明显者性差异(ρ〈0.05，ρ〈0.01);结果显不:氣化铜恭露20min，细胞内锌离子和钙离子均出现显著上升，提示重金属铜可能通过取代NOS 二聚体中的锌离子和钙离子，使NOS 二聚体解聚，NO合成量下降。图3为ImM氯化铜暴露0、2、4、6、8h，nNOS, eNOS, iNOS的mRNA相对表达示意图；图中:星号(*)，(**)表明显者性差异(ρ〈0.05，ρ〈0.01);结果显不:ImM氣化铜恭露8h，nNOS, eNOS的mRNA表达出现反馈性的上调，iNOS的mRNA表达和对照组相比虽然没有出现显著上调，但同样存在一个上升的趋势。图4为ImM氯化铜暴露0、2、4、6、8h，nNOS, eNOS, iNOS蛋白表达示意图；图中:与NOS的mRNA表达不同，NOS蛋白表达未检测出相应上调。其中，eNOS, iNOS的蛋白表达反而出现一定程度的下调。图5为ImM氯化铜暴露0、2、4、6、8h，P - eIF2a的表达示意图。图6为ImM氯化铜以及ImM氯化铜和25mM LNAC共处理6h对p - eIF2 a表达的影响示意图。图5和图6中:氯化铜暴露使得P - eIF2a的表达上调，加入LNAC，去除自由基，氯化铜诱导的P - eIF2 a上调被抑制。说明，氯化铜诱导的P _ eIF2 a表达上调与细胞内活性氧有关，氯化铜通过生成活性氧，产生氧化胁迫，诱导翻译起始因子磷酸化。图7为ImM氯化铜，ImM氯化铜和1mM L - Arg, ImM氯化铜和25mM LNAC共处理6h细胞内活性氧含量变化示意图；图中:星号(*)，(**)表明显著性差异(p〈0.05，p〈0.01);结果显示:ImM氯化铜本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种一氧化氮合成酶NOS的应用，其特征在于，利用重金属铜能够使其二聚体解聚的特性，将其用于重金属铜细胞毒性的检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周培，陆伟，钟玲盈，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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