本发明专利技术公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法。所述引物组包括三对引物，第一对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.1～2所示，第二对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.3～4所示，第三对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.5～6所示。该引物组有极强的特异性，每一对引物仅能扩增相应病害的病原菌特异性片段，因此可用于对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行同时、快速、准确的检测鉴定。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法。所述引物组包括三对引物，第一对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.1～2所示，第二对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.3～4所示，第三对引物的上下游序列分别如SEQ?ID?No.5～6所示。该引物组有极强的特异性，每一对引物仅能扩增相应病害的病原菌特异性片段，因此可用于对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行同时、快速、准确的检测鉴定。【专利说明】—种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法
本专利技术属于植物病原菌检验检疫领域，具体涉及一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法。
技术介绍
水稻是最重要的粮食作物，世界上一半人口以水稻为生。随着水稻种质资源的调运日益频繁，一些水稻病害随种子调运而严重扩散，对稻米产量造成了不可挽回的损失。因此，重视并加强检验检疫工作，对切实保障稻米生产安全及产地生态安全有着重要的意义。 此外，我国加入WTO后，在植物出入境检疫方面亦面临着空前的挑战。为确保我国农业的可持续发展，必须一方面有效制止病虫害传入我国，另一方面则要保证我国出口的农产品符合进口国的要求。而这些检疫、防疫工作的落实则依赖灵敏、准确以及便捷的病原检测技术的发展和应用。2007年，农业部汇同国家质量监督检验检疫总局共同制定了《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，该目录中明确规定水稻白叶枯病(Rice bacterial leaf blight)、水稻细菌性条斑病(Rice bacterial leaf streak)和水稻细菌性谷枯病 (Bacterial grain rot)为水稻的检疫性病害。由于带菌种子是这三种病害的主要初侵染源与传播途径，因此及早检测发现种子上的病原菌及有无症状病害，对于预防及采取相应措施加以防治、指导生产、减少经济损失等均有着重要的意义。现阶段已有许多技术应用到对水稻白叶枯病、细菌性条斑病和细菌性谷枯病的检验检疫，例如经典的产地检验、育苗生长观察法、选择性分离、噬菌体检测、致病性测定、免疫分离、血清学检测技术等，但主要还是依据三种病原菌的生理生化差异来区分。根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》中关于水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌的检测方法规定，对于出入境种子首先需要进行样品的清洗、研磨并获得提取液，然后进行 SPA的平板培养，或利用ELISA试剂盒对提取液进行快速筛选检测。对于检测结果呈阳性的还需进行进一步的平板分离和生化鉴定。整个过程程序复杂，耗时长，且仍有可能造成假阳性。近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR技术已广泛用于水稻白叶枯病、细菌性谷枯病和细菌性条斑病的检测(TakeuchiT, Sawada H, Suzuki F，et al.Specific detection of Burkholderia plantarii and B.glumae by PCR using primers selected from thel6S_23S rDNA spacer regions .The Phytopathological Society of Japan，1997，63 (6):455—462.；Cottyn Bj Bautista A Tj Nelson R J，et al.Polymerase chain reaction amplification of DNA from bacterial pathogens of rice using specific oligonucleotide primers.1nt Rice Notes，1994，19:30~32.；GnanamanickamSSj Sakthivel N，Nelson R J，et al.Evaluation of Culture Media and Molecular Probesfor Detection of Xanthomonas oryzae pv.0ryzae in Rice.1n:Verma J Pj VarmaA,KUMAR Dj ed.Detection of Plant Pathogens and Their Management.New Delh1: Angkor Publishers, 1995，336~349.;张华，姜英华，胡白石，等.利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌.植物病理学报，2008，38(1):1~5.;怀雁，等.水稻细菌性谷枯病菌的实时荧光PCR检测技术研究.中国水稻科学，2003，23(1):107~110.;张华，胡白石，刘凤权.双重PCR技术检测水稻白叶枯病菌和细菌性条斑病菌.植物检疫，2007，21增刊)。但是，现有技术只能对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌中的一种或两种进行检测鉴定，能同时对这三种病原菌进行检测鉴定的方法仍未见报道。
技术实现思路
本专利技术公开了一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，利用该引物组可以同对水稻白枯叶病原菌、水稻细菌性条斑病原菌和水稻细菌性谷枯病原菌这三种病原菌进行快速、准确的检测鉴定。多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，包括三对引物:第一对引物的碱基序列为:上游引物:5'-CCTCTATGAGTCGGGAGCTG-3'；下游引物:5'-ACACCGTGATGCAATGAAGA-3'；第二对引物的碱基序列为:上游引物:5'-CAAGACAGACATTGCTGGCA-3'；下游引物:5'-GGTCTGGAATTTGTACTCCG-3'；第三对引物的碱基序列为:上游引物:5'-TCATCCTCTGACTGGCTCAA-3'；下游引物:5'-CGCTTCCGCTATCCACTTTA-3'。在GenBank中搜索水稻白叶枯病原菌(Xanthomonas.0ryzae pv.0ryzae)和细菌性条斑病原菌(X.0ryzae pv.0ryzicola)的基因并进行BLAST比对,分别获得了水稻白叶枯病原菌的特异性基因Glycosyltransferase (GenBank号为:AF169030.1，编码糖基转移酶Glycosyltransferase),以及细菌性条斑病原菌的特异性基因AvrRxo (GenBank号为: AY395713.1)。针对X.0ryzae pv.0ryzae 在 Glycosyltransferase 基因的特异性位点设计了所述第一对引物，针对X.0ryzae pv.0ryzicola在AvrRxo基因的特异位点设计了所述第二对引物。对水稻细菌性谷枯病原菌(Burkolderia glumae)的16s rDNA (GenBank号为: D87080)进行 BLAST 搜索,获得了与其同源性极高的 B.plantarii, B.gladioli, B.cepalia 的16s rDNA序列；对这些序列进行比对,发现了 B.glumae的16s rDNA的保守区和特异性区域，针对该特异性区域设计了所述第三对引物。本专利技术还提供了一种多重PCR法检测水稻检本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重PCR法检测水稻检疫性病原菌的引物组，其特征在于，包括三对引物：第一对引物的碱基序列为：上游引物：5′?CCTCTATGAGTCGGGAGCTG?3′；下游引物：5′?ACACCGTGATGCAATGAAGA?3′；第二对引物的碱基序列为：上游引物：5′?CAAGACAGACATTGCTGGCA?3′；下游引物：5′?GGTCTGGAATTTGTACTCCG?3′；第三对引物的碱基序列为：上游引物：5′?TCATCCTCTGACTGGCTCAA?3′；下游引物：5′?CGCTTCCGCTATCCACTTTA?3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王雪艳，陆雯，潘潞琪，姚含笑，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：
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