一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用技术

本发明专利技术公开了一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。本发明专利技术提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：（1）将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时；（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。在倏逝波激发下，可实时监测核酸芯片表面固定的核酸与互补核酸的杂交情况，同时该核酸芯片还可洗脱再生，实现重复使用（可重复使用50次以上）。

【技术实现步骤摘要】
一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用
本专利技术涉及一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。
技术介绍
倏逝波检测技术是一种新型的检测技术，它是利用光波在基质内以全反射方式传输时在基质表面产生倏逝波，可以激发连接在基质表面标记有荧光分子的生物物质，从而实现对待测目标物定量或定性的检测。由于其具有不直接与待测物发生作用，穿透深度仅有数百纳米的特点，因而可有效降低噪音，消除体相中杂质的干扰，特别适合复杂环境中待测目标物的检测。近年来，专利技术人所在课题组开发出多种基于倏逝波检测技术的方法和仪器（如：专利CN1873450A、CN101363870A、CN1966440A、CN101666747A等）并将其成功用于水体中藻毒素、2、4-D等化合物的检测之中，取得了较好的效果。现代分子生物学研究发现，在分子水平上某些小分子（如金属离子、农药等）可与特异的基因序列发生作用，造成其空间结构发生改变，而这种结构和性能的关系为这类小分子的快速、特异识别提供了一条便捷的途径。上述能够发生特异结构变化的DNA或RNA链，被称为功能核酸（FunctionalNucleicAcids，FNAs）。2008年MA.Shannon等在《Nature》上发表文章“Scienceandtechnologyforwaterpurificationinthecomingdecades”指出未来二十年，功能核酸（如核酸酶、核酸适体等）为代表的检测技术在环境污染物的分析上具有广阔的应用前景。利用先前开发的修饰方法，很难消除由于功能核酸在表面的非特异吸附，造成的固定效率差信号、背景噪音大、重复性不好等问题，因而急需开发功能核酸的固定化方法。鉴于检测的需要，该方法形成的修饰层应该满足以下条件：（1）能与倏逝波检测芯片共价结合，不影响芯片的物化性质；（2）能与不同基团（氨基、巯基和羧基等）修饰的寡聚核苷酸形成共价连接；（3）修饰的寡聚核苷酸数量可控；（4）非特异吸附小，背景信号低；（5）稳定性好，可多次重复使用，降低使用成本。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备核酸芯片的方法及其在倏逝波检测中的应用。本专利技术提供的制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：（1）将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min（如90min-120min、90min或120min）后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时（具体可200℃烘烤12小或130℃烘烤1小时）；（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。所述步骤（1）中，所述基片可为硅片、石英片、玻璃片或光纤。所述步骤（1）中，所述SiO2膜的厚度可为20nm以上（如50nm）。所述步骤（1）中，所述“进行表面羟基活化”的方法如下：将表面具有SiO2膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-110℃静置45-90分钟（具体可90℃静置60分钟）后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120℃静置3-12h（具体可110℃静置8小时）。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法可如下：将3体积份浓硫酸和1体积份30%过氧化氢混合。所述硫酸-过氧化氢溶液的制备方法具体具体如下：将3体积份浓硫酸（即质量分数为98.3%的硫酸溶液）和1体积份30%过氧化氢（即质量分数为30%的过氧化氢溶液）混合。所述步骤（2）中，所述硅烷化剂具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧基，优选为APTES或MTS。所述步骤（2）中，所述硅烷化剂溶液可由硅烷化剂和有机溶剂组成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为（0.4-5）：100，优选为2：100、0.4：100、5：100或4：100。所述有机溶剂可为甲苯或二甲苯。所述步骤（3）中，所述偶联剂为如下（a）或（b）或（c）或（d）：（a）戊二醛；（b）GBMS；（c）EDC和NHS；（d）PIDTC。所述步骤（3）中，所述“通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面”的方法如下：将步骤（2）得到的基片浸泡于偶联剂溶液，室温静置30-120min(如60-90min、90-120min、60min、90min或120min)后取出基片，洗涤并干燥，然后在表面滴加核酸分子溶液，室温静置（具体可为48小时），洗涤后用蛋白（如牛血清蛋白）进行封闭。所述偶联剂溶液中，每种偶联剂的体积百分浓度可为0.4%-5%，如0.4%-2%，2%-2.5%、2.5%-4%、4%-5%。所述偶联剂溶液的溶剂可为PBS缓冲液（如pH7.4的PBS缓冲液）、乙醇、MES缓冲液（如pH4-6的MES缓冲液，优选为pH5的MES缓冲液）或DMF。所述偶联剂溶液具体可为含5%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含0.4%（体积比）GBMS的乙醇溶液。所述偶联剂溶液具体可为含4％（体积比）EDC和4％（体积比）NHS的pH5、0.1M的MES缓冲液。所述偶联剂溶液具体可为含2.5%PIDTC的DMF。所述偶联剂溶液具体可为含2%（体积比）戊二醛的PBS缓冲液。所述核酸可为脱氧核糖核酸、核糖核酸或肽核酸。以上任一所述方法制备得到的核酸芯片也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护所述核酸芯片在倏逝波检测中的应用。本专利技术中通过预处理－硅烷化－高温烘烤－偶联化－固定寡聚核苷酸的工艺流程，在SiO2芯片表面有效的固定了核酸，得到了核酸芯片，固定密度可达108－1013个/cm2。在倏逝波激发下，可实时监测核酸芯片表面固定的核酸与互补核酸的杂交情况，同时该核酸芯片还可洗脱再生，实现重复使用（可重复使用50次以上）。附图说明图1为实施例1的结果。图2为实施例2的结果。图3为实施例3的结果。图4为对比例的结果。图5为实施例4的结果。图6为实施例5的结果。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。APTES：购自sigma-aldrich；中文名称为“3-氨丙基三乙氧基硅烷”，分子式为“H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3”，CAS号为“919-30-2”，结构式如下：MTS：购自Acros；英文全称为（3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane，中文名称为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，分子式为“HS(CH2)3Si(OCH3)3”，CAS号为“4420-74-0”，结构式如下：MES：购自sigma-aldrich；英文全称为morpholineethanesulfonicacid，中文名称为2-吗啉乙磺酸，分子式为“C6H13NO4S”，CAS号为“4432-31-9”，结构式如下：DMF：购自sigma-aldrich；英文名称为N,N-DimethylFormamide，中文名称为二甲基甲酰胺，分子式为“C3H7NO”，CAS号为“68-12-2”。NHS：购自sigma-aldrich；英文名称为N-Hydroxysuccinimide，中文名称为N-羟基琥珀酼亚胺，分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备核酸芯片的方法，依次包括如下步骤：（1）将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；（2）将步骤（1）得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30‑120min后取出基片，洗涤并干燥，然后130‑200℃烘烤1‑12小时；（3）通过偶联剂将核酸分子固定到基片的表面，得到核酸芯片。

【技术特征摘要】
1.一种用于倏逝波检测的核酸芯片的制备方法，依次包括如下步骤：(1)将表面具有SiO2膜的基片进行表面羟基活化；所述“进行表面羟基活化”的方法如下：将表面具有SiO2膜的基片浸泡于硫酸-过氧化氢溶液，70-110℃静置45-90分钟后取出基片，洗涤并干燥，然后100-120℃静置3-12h；(2)将步骤(1)得到的基片浸泡于硅烷化剂溶液，室温静置30-120min后取出基片，洗涤并干燥，然后130-200℃烘烤1-12小时；所述硅烷化剂具有一个可与偶联剂反应的活性基团和3个硅氧基，为APTES或MTS；所述硅烷化剂溶液由硅烷化剂和有机溶剂组成；所述硅烷化剂与所述有机溶剂的体积配比为(0.4-5)：100；所述有机溶剂为甲苯...

【专利技术属性】
技术研发人员：何苗，韩世同，施汉昌，周小红，龙峰，刘兰华，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11