基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片和方法技术

本发明专利技术一种基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片、制备方法和应用。其特征在于所述的数字PCR芯片是用一定量表面活性剂掺杂的PDMS材料制备PDMS数字PCR阵列芯片，利用预脱气薄型PDMS芯片自身的高空气溶解特性实现进样和分配过程，并且制成玻璃‑改性PDMS‑玻璃的“三明治”夹心结构抑制水分挥发。该芯片的设计方法，降低了PDMS对生物分子的静电吸附，有效提高了液滴的稳定性和抗挥发性，从而提高了PCR的扩增效率。而且与目前已报道的数字PCR芯片技术相比，成本低，操作简便，应用前景非常广泛。

【技术实现步骤摘要】
基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片和方法
本专利技术涉及一种用于核酸定量检测的数字PCR芯片和方法，更确切地说涉及基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片和方法，有望应用于生物学、医学及环境科学等领域。
技术介绍
上世纪90年代后期提出的荧光定量PCR(FluorescenceQuantitativePolymeraseChainReaction，FQ-PCR，qPCR)已发展成为分子生物学领域的一项关键技术和常规技术，极大地推动了生命科学各个领域的发展。但是，影响PCR扩增效率的因素很多，很难保证实际样品与标准样品以及不同样品之间的扩增效率是否相同，由此导致其定量分析所依赖的基础—循环阈值(CyclingThresholdValue，Ct)不是恒定不变的。因此qPCR的定量只是“相对定量”，其准确度和重现性依然不能够满足分子生物学定量分析的要求。另外，由于PCR扩增产物对酶催化反应的抑制作用，目前基于PCR技术的基因变异检测方法对体细胞中低丰度的基因变异的检测常常无能为力。20世纪末提出的数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微液滴或微阵列方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微液滴或微反应腔中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR不同，数字PCR通过直接计数的方法，可以实现起始DNA模板的绝对定量。此外，数字PCR还可以在大量的野生型DNA背景中鉴定出微量突变体的方法。由于数字PCR技术可以将模板DNA分子事先分隔开来单独进行扩增，就避免了高丰度等位基因核酸对变异核酸的扩增抑制，因此其在检测和定量稀有突变方面其灵敏度和准确度是普通PCR和qPCR所无法匹及的。数字PCR提出至今，因其绝对定量的独特优势，其相关技术和产业化发展都非常迅速。迄今，已有报道的数字PCR平台主要有两大类：液滴式和阵列式。最早的液滴式数字PCR采用油相液相高速混合的方式制备微液滴，制备的液滴尺寸均一性差，后来随着微流控技术的发展，利用T型、十字型等微通道水油两相切割实现了更小体积，更高通量的单分散微液滴数字PCR平台。例如已经商品化的BioRad公司的QX100TM微滴式dPCR系统等，但是这些平台一般都需要液滴产生、收集、转移、反应、快速读出分析等步骤，相关仪器操作繁琐，成本过高，不利于产品和研究的普及。另外液滴易受环境因素的影响，相互融合，稳定性较差。阵列式数字PCR平台发展至今可大致分为微孔板，集成流路微阀和集成流路微腔结构。微孔板平台从早期的与传统qPCR相同的96/384孔板到Lifetechnology公司的OpenArray刻蚀孔板，虽然灵敏度提高，样品耗量降低，但是人工移液器加样易产生污染也无法快速精确取样，若借助自动点样仪或机械手等设备，又增加了仪器成本，而且较少的液滴分解数目始终限制了其精度和可测的动态范围，应用受限。以微电子技术为基础的微流控芯片加工技术的发展实现了微流控芯片的微型化、集成化、迅速高效、耗样少以及适于现场检测，令数字PCR拥有了更大的发展空间。典型的技术成果包括Fluidigm公司的BioMarkTM系统，系统外接机械泵，加压控制芯片中的微阀隔断通道，形成独立的反应器，属于在芯片中集成微阀的数字PCR平台，但外接泵使芯片操作变得复杂，不利于快速、现场检测。另外一种集成流路微腔结构，是利用各种设计原理，如玻璃滑片、离心作用、油相阻隔等，实现无阀式微腔，在拥有集成微型、迅速高效等所有优势的同时，更加简化了操作，是未来数字PCR技术发展的趋势。PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)是一种具有弹性的高分子聚合物，因其成本低，使用简单，而且具有良好的光学特性，良好的绝缘性，良好的化学惰性以及良好的透气性等特点，成为一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。在数字PCR领域，PDMS被广泛用于制作液滴生成芯片，直接在PDMS芯片上进行数字PCR扩增及分析的例子较少，主要原因是一PDMS透气性强，易造成样本挥发，二是PDMS表面强疏水性，易吸附生物大分子，降低生物反应的效率。近几年来也有少数无阀式微腔PDMS芯片，并直接在片上进行PCR扩增的例子，他们针对PDMS挥发性问题主要采用两种方法，旋涂聚对二甲苯或者在芯片上制备循环水压力装置防止挥发。旋涂聚对二甲苯所需工艺条件较为复杂，一般实验室无法满足该条件，且其水蒸气透过率远大于玻璃的水蒸气透过率；而在芯片上制备循环水压力装置一方面大大提高芯片的成本，且增加了芯片制备及数字PCR反应操控的难度。针对PDMS表面性质问题目前的方法主要采用预先充盈BSA进行预封闭或者在PCR预混液中添加BSA和表面活性剂的方式。对基于微管道的数字PCR芯片预先充盈BSA进行预封闭的方法会因预封闭液去除不净影响PCR反应液进样，而在PCR预混液中添加BSA和表面活性剂会影响PCR反应效率，且封闭效果不佳。本专利技术拟提供一种基于表面活性剂改性PDMS、无源进样和“三明治”封装结构的薄型数字PCR芯片及制作方法。本专利技术利用PDMS掺杂表面活性剂对PDMS进行改性，克服芯片表面对生物、化学分子的静电吸附作用，利用PDMS天然空气泵的特性将液体样品自动进样和分割成独立反应单元，制备薄型PDMS及玻璃-改性PDMS-玻璃夹心结构，达到良好的抗水分挥发效果，与目前已有的数字PCR芯片技术相比，成本低，操作简便，应用前景广泛。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于表面活性剂改性PDMS的数字PCR芯片、制备方法和应用，建立一种基于PDMS材料的数字PCR方法，简化制作方法和样品操作，降低数字PCR成本，以利于该技术的推广运用。所述的PCR芯片是用一定量表面活性剂掺杂的PDMS材料制备PDMS数字PCR阵列芯片，利用预脱气薄型PDMS芯片自身的高空气溶解特性实现进样和分配过程，并且制成玻璃-改性PDMS-玻璃的“三明治”夹心结构抑制水分挥发。本专利技术所述的芯片的制备包括芯片的制备、样品的自动进样分离以及PCR扩增。所叙述的芯片制备材料为玻璃可用一般的载玻片或盖玻片、PDMS、表面活性剂以及矿物油(如液体石蜡等)。具体制作步骤包括：1.芯片的制备由于芯片上进行PCR扩增的反应器是一个个独立的柱形反应腔，所以PCR样品会与四周的PDMS表面接触，疏水表面的静电吸附作用成为抑制PCR扩增的巨大障碍。另外，PDMS的高透气性特点促使样品透过其发生严重挥发，导致扩增失败。表面活性剂(surfactant)是一类两亲性分子，一端为亲水基团，另一端为疏水基团；亲水基团常为极性基团，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基或胺基及其盐，羟基、酰胺基、醚键等也可作为极性亲水基团；而疏水基团常为非极性烃链，如8个碳原子以上烃链。表面活性剂在溶液的表面能定向排列，加入少量就能使溶液体系的界面状态发生明显变化。本专利技术先将一定量的表面活性剂混合在PDMS单体中，具体是每100gPDMS单体中掺入0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于表面活性剂改性的PDMS数字PCR芯片，其特征在于所述的芯片为基于表面活性剂改性PDMS、无源进样和“三明治”封装结构的数字PCR芯片；微腔阵列区是由微通道衔接各个独立的柱形反应腔；①所述的表面活性剂改性PDMS是100g PDMS单体中掺杂0.1‑1g的表面活性剂，交联固化后表面活性剂的疏水基团与PDMS结合，亲水基团朝向外侧在PDMS表面形成一层单分子层；PDMS的底面分布有微通道和微反应腔；②所述的无源进样是利用PDMS天然空气泵的特性将液体样品自动进样和分割成独立反应单元；③所述的“三明治”封装结构为玻璃‑改性PDMS‑玻璃夹心结构。

【技术特征摘要】
2015.12.31 CN 20151102884711.一种基于表面活性剂改性的PDMS数字PCR芯片，其特征在于所述的芯片为基于表面活性剂改性PDMS、无源进样和“三明治”封装结构的数字PCR芯片；微腔阵列区是由微通道衔接各个独立的柱形反应腔；①所述的表面活性剂改性PDMS是100gPDMS单体中掺杂0.1-1g的表面活性剂，交联固化后表面活性剂的疏水基团与PDMS结合，亲水基团朝向外侧在PDMS表面形成一层单分子层；PDMS的底面分布有微通道和微反应腔；②所述的无源进样是利用PDMS天然空气泵的特性将液体样品自动进样和分割成独立反应单元；③所述的“三明治”封装结构为玻璃-改性PDMS-玻璃夹心结构。2.按权利要求1所述的芯片，其特征在于：①所述的表面活性剂为Triton100，Tween20、Span80或甜菜碱；直接掺杂在PDMS单体中；固化后表面活性剂聚集在PDMS表面；②“三明治”结构中的玻璃为盖玻片或载玻片，厚度分别为150-570μm；中间有图形结构的PDMS芯片厚度为0.5-2mm；③PDMS芯片是由PDMS预聚体与固化剂按质量比为10:1混合搅匀制成的。3.制备如权利要求1或2所述的芯片方法，其特征在于制作步骤包括：(1)模具的设计与制作芯片结构是由进样区、阵列区及出样区三部分组成；首先用CAD软件设计图案打印掩膜板，然后利用负性光刻胶SU83050在硅片上分层制作微管道和微反应腔；进样区和出样区微管道宽度160微米，进样口到达每条主通道的距离相等，具有相同的流阻，同样的设计宗旨应用在出样区；(2)PDMS芯片的制备在上述(1)的硅片模具制作完成后，通过软刻蚀模塑法浇铸PDMS芯片，首先将PDMS预聚体与固化剂按质量比10:1，混合，搅匀，然后再将该混合物按每100g加入0.1～2.0g表面活性剂的比例再次混合，搅匀，抽真空除气，倾倒于上述模具上，另外在载...

【专利技术属性】
技术研发人员：景奉香，符亚云，李刚，
申请(专利权)人：中国科学院上海微系统与信息技术研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31