具有可供选择的结合表面的基于III型纤连蛋白重复的蛋白质支架制造技术

本发明专利技术涉及基于具有可供选择的结合表面设计的III型纤连蛋白(FN3)重复、编码蛋白质支架的分离的核酸、载体、宿主细胞的蛋白质支架和支架文库以及其制备方法用于产生治疗性分子以及疾病和病症的治疗和诊断。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及基于具有可供选择的结合表面设计的III型纤连蛋白(FN3)重复、编码蛋白质支架的分离的核酸、载体、宿主细胞的蛋白质支架和支架文库以及其制备方法用于产生治疗性分子以及疾病和病症的治疗和诊断。【专利说明】具有可供选择的结合表面的基于111型纤连蛋白重复的蛋白质支架
本专利技术涉及具有可供选择的结合表面设计的基于III型纤连蛋白(FN3)重复的蛋白质支架和支架文库。更具体地，本专利技术涉及具有由挑选的β_链和环形成的凹型结合位点的FN3支架和文库。
技术介绍
当需要对靶分子的高亲和力和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用类型的治疗蛋白。然而，具有可被工程改造以结合期望的靶分子的相对确定的三维结构的非抗体蛋白质，通常称为蛋白质支架，因为它们的小尺寸、缺乏二硫键、高稳定性和能够在原核宿主中表达，故它们可能具有优于传统抗体的优点。这些支架通常含有可接受特异性或随机序列变异的一个或多个区域，并且经常进行这种序列随机化以产生从中可选择期望产物的蛋白质的文库。可容易地应用新型的纯化方法；支架容易与药物/毒素缀合，有效地渗透进组织并且可被设计为多特异性结合物(Binz 和 Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16,459-469,2005 ;Skerra,J Mol Recognit,13,167-187, 2000)。一种此类蛋白质支架是在多种蛋白质中鉴定的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其具有其中6个环由7个β链连接的典型三级结构。三个环(具体地，FG、BC和DE环)在结构上类似于抗体的互补决定区(⑶R)。这些环已被随机化来产生FN3结构域支架的文库以成功地选择许多不同靶 标的特异性结合物而同时保留重要的生物物理特性(Getmanova等人，Chem Biol, 13，549-556，2006 ；Hackel 等人，J MolBiol, 381,1238-1252，2008 ；Karatan等人，Chem Biol，11，835-844，2004 ;Koide 等人，J Mol Biol, 284,1141-1151,1998 ；Koide等人，Proc NatlAcad Sci U SA, 104,6632-6637,2007 ;Parker 等人，Protein Eng DesSel，-18，435-444，2005 ；Xu 等人，Chemistry & Biology, 9，933-942，2002)。也通过使 AB、EF和CD环随机化而产生FN3结构域的文库(美国专利公布2011/0038866 ;国际专利公布W02011/05133 ;美国专利公布2011/0124527)。对于FN3文库的其它参考文献包括国际专利公布 W02002/32925、W02003/104418、W02009/023184 和 W02010/060095。国际专利公布W02012/016245描述了使用⑶和FG环连同β -折叠的表面暴露残基的FN3结构域。有利的是获得用于治疗和诊断两种目的的改善的纤连蛋白结构域支架蛋白质。本公开提供此类改善的蛋白质。
技术实现思路
本专利技术的一个实施例是制备III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的文库的方法，所述文库具有由CP -链、⑶环、FP -链和FG环形成的多样化C-⑶-F-FG可供选择的表面，所述方法包括:提供具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；通过使至少一个C β -链残基和至少一个F β -链残基突变来将多样性引入到参考FN3结构域多肽中以形成具有多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。本专利技术的另一个方面是由本文所述的本专利技术的方法制备的文库。本专利技术的又一个方面是获得包含III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有与靶分子特异性地结合的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括使权利要求11的文库与靶分子接触或用靶分子淘选权利要求11的文库，以及分离以预定亲和力与靶分子特异性地结合的蛋白质支架。【专利附图】【附图说明】图1示出FN3结构域和抗体VH结构域结构的条带图。标记出了在结构上与⑶R类似的FN3结构域的环。图2示出结构图，其使得在以下之间进行比较:A)具有随机化环的常规FN3文库(图2A) ；B)具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3文库(TCL14文库)(图2B) ；C)具有随机化A-AB-B-BC-E表面的FN3文库(TCL15文库)(图2C)。这些文库设计中被随机化的位置在条带图中被描绘为实心黑色。图3示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的TCL14文库(SEQ ID NO:28)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指不特定环和链区域。图4示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面的TCL15文库(SEQ ID NO:61)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β -链区域。图5示出对Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化C-⑶-F-FG可供选择的表面(TCN14文库)。将β -链描绘为箭头，其中在Tencon27结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描O图6示出对Tencon27 (SEQ ID NO: 27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面(TCL15文库)。将β -链描绘为箭头，其中在tencon结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描4-ΛO图7示出在TCL14文库中随机化位置处预期的和观察到的氨基酸分布。图8示出Tencon27、TCL14和对FN10、TN3和Fibcon的设计的文库的序列比对，所述Fibcon具有随机化C-⑶-F-FG可供选择的表面。残基编号基于Tencon27序列。分别以SEQ ID N0:28、98、99和62示出文库的氨基酸序列。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。【具体实施方式】如本文所用，术语“III型纤连蛋白模块(FN3)结构域”或“FN3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork 和 Doolittle，Proc Nat Acad Sci USA89，8990-8994，1992 ；Meinke等人，J Bacterioll75，1910-1918，1993 ;Watanabe 等人，J Biol Chem265，15659-15665，1990)。示例性的FN3结构域(或模块)是存在于人腱生蛋白C中的15种不同的FN3结构域和存在于人纤连蛋白(FN)中的15种不同的FN3结构域。单独的FN3结构域通过结构域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第3FN3结构域(TN3)，或纤连蛋白的第10FN3结构域(FNlO)。如本文所用，术语“参考FN3结构域”指野生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备III型纤连蛋白模块（FN3）结构域的文库的方法，所述文库具有由C β‑链、CD环、F β‑链和FG环形成的多样化C‑CD‑F‑FG可供选择的表面，所述方法包括：a. 提供具有与SEQ ID NO: 27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；b. 通过使至少一个C β‑链残基和至少一个F β‑链残基突变来将多样性引入到所述参考FN3结构域多肽中以形成具有所述多样化C‑CD‑F‑FG可供选择的表面的FN3结构域文库。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M迪伊姆，S贾科布斯，
申请(专利权)人：詹森生物科技公司，
类型：发明
国别省市：美国;US