本发明专利技术公开了一种基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用，检测试剂包括引物、肽核酸荧光探针及野生型互补的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3、NO.5、NO.7；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4、NO.6、NO.8；肽核酸荧光探针如序列表中SEQ ID NO.9、NO.10、NO.11、NO.12；野生型互补肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.13、NO.14、NO.15、NO.16。本发明专利技术从转录水平能快速发现Wnt信号通路中Bcl-9基因突变情况，为抗癌药物筛选，新靶向药物探讨、基础科学研究提供工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学生物核酸检测
，具体涉及一种基于肽核酸探针的 Wnt信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。
技术介绍
Wnt信号通路广泛存在于无脊椎动物和脊椎动物中，是一类在物种进化过程中高 度保守的信号通路。fct信号在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其它生理过 程中，具有至关重要的作用。如果这条信号通路中的关键蛋白发生突变或者异常表达，导 致信号异常活化，就可能诱导癌症的发生。Wnt信号通路包括经典的Wnt信号通路与非经 典的fct信号通路，在经典通路即Wnt-β -catenin信号通路中，Wnt因子通过激活细胞膜 上的Frizzle/LRP5/6协同受体后抑制细胞内游离β -catenin蛋白的磷酸化和降解，细 胞质中的β-catenin蛋白水平升高后将发生β-catenin蛋白的核移位，导致细胞核中 β -catenin蛋白升高，胞核中β -catenin蛋白能够联合Pygo2、Bcl-9以及FoxMl蛋白共 同与TCF/LEF-1转录因子家族形成复合体并激活Wnt信号通路下游靶基因的转录激活。 Bcl-9蛋白是Wnt信号通路中β-catenin下游重要成员之一，目前越来越多的研 宄已经发现，除了 Pyg〇2蛋白和FoxMl蛋白外，在很多肿瘤中Bcl-9蛋白也是呈现高表达 的。 目前研宄核心信号通路的核心分子调控机制，以及某些重要成员在细胞中的表达 水平，已经成为治疗肿瘤的一种关键手段，虽然近年来fct信号通路在癌症中的研宄，以及 Bcl-9蛋白作为Wnt信号通路重要成员其表达水平的研宄，已经成为研宄开发肿瘤药物急 需解决的重要问题，但是同时其在很多肿瘤细胞中基因的突变也越来越多，对Bcl-9蛋白 发挥功能起着非常重要的作用，例如在结直肠腺癌细胞中检测出P77L突变，前列腺癌细胞 中检测出T365I突变，肾脏肾透明细胞癌细胞中检测出的P546R突变以及肺鳞状细胞癌中 检测出的G1106V突变。 肽核酸（peptide nucleic acids，PNA)是一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA 类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成 的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键 取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱 基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷， 与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或 DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA 分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识 别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现状，旨在提供一种能确定Wnt信号通路中核心的信号 分子Bcl-9基因突变情况，能解释核心分子Bcl-9在肿瘤细胞中变化，结果重复性，敏感性 好的基于肽核酸探针的fct信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂、PCR检测方法及应用。 本专利技术目的的实现方式为，基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Bcl-9基因突变的 检测试剂，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针， 其特征在于： 所述检测Bcl-9基因 P77L突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 ; 所述检测Bcl-9基因 P77L突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 ; 所述检测Bcl-9基因 T365I突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 3 ; 所述检测Bcl-9基因 T365I突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 4 ; 所述检测Bcl-9基因 P546R突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 5 ; 所述检测Bcl-9基因 P546R突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 6 ; 所述检测Bcl-9基因 G1106V突变正向引物如序列表中SEQ ID NO. 7 ; 所述检测Bcl-9基因 Gl 106V突变反向引物如序列表中SEQ ID NO. 8 ; 所述检测Bcl-9基因 P77L突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 9 ; 所述检测Bcl-9基因 T365I突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 10 ; 所述检测Bcl-9基因 P546R突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 11 ; 所述检测Bcl-9基因 Gl 106V突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO. 12 ; 所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰 所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,修饰所述3'端的 淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL0 基于肽核酸探针的fct信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂进行检测的方法， 检测方法为PCR检测方法，所述PCR检测方法为基于肽核酸为荧光探针的实时荧光定量PCR 方法； 所述实时荧光定量PCR的反应体系为：正向引物、反向引物、DEPC水、具有5' 一3' 外切活性的 DNA 聚合酶、dNTPs、10XPCR Buffer、RNASIN、M-MLV 逆转录酶、oligo(dT)和含 Mg离子的溶液； 所述具有5' 一 3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂的应用，用于制备 检测肿瘤细胞及正常细胞的检测试剂，所述癌细胞为结直肠腺癌、前列腺癌、肾脏肾透明细 胞癌或肺鳞状细胞癌。 本专利技术采用特异序列的PNA寡聚物作为探针。由于PNA是一种人工合成的核酸的 类似物，并且为非手性、不带电荷的分子，避免了寡核苷酸与其靶基因结合时因电荷相互排 斥所导致的杂交不稳定性，结合不易受杂交液离子强度的影响，从而显示出极强的杂交优 势，大大提高了检测灵敏度。 与现有技术相比，本专利技术的优点和积极效果是：Bcl-9基因是Wnt信号通路中 β-catenin蛋白下游的发挥着重要功能的基因，本专利技术提供了直接检测Wnt信号通路中 Bcl-9基因突变检测的试剂，借助于所述检测试剂能够通过实时荧光定量PCR法在转录水 平快速检测出Bcl-9基因的突变，而与普通实时荧光定量PCR不同的是，我们使用的肽核酸 PM荧光探针更加灵敏，本专利技术为抗癌药物的筛选，新靶向药物的机制研宄都提供了非常有 力的工具。【附图说明】 图1是本专利技术实施例中所述肽核酸质谱图； 图2是本专利技术实施例中所述P77L突变型和野生型参考品PCR扩增图； 图3是本专利技术实施例中所述T365I突变型和野生型参考品PCR扩增图； 图4是本专利技术实施例中所述P546R突变型和野生型参考品PCR扩增图； 图5是本专利技术实施例中所述G1106V突变型和野生型参考品PCR扩增图。【具体实施方式】 基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Bcl-9基因突变的检测试剂，包括引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于肽核酸探针的Wnt信号通路中Bcl‑9基因突变的检测试剂，包括引物和探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述探针为肽核酸探针，其特征在于：所述检测Bcl‑9基因P77L突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.1；所述检测Bcl‑9基因P77L突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.2；所述检测Bcl‑9基因T365I突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.3；所述检测Bcl‑9基因T365I突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.4；所述检测Bcl‑9基因P546R突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.5；所述检测Bcl‑9基因P546R突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.6；所述检测Bcl‑9基因G1106V突变正向引物如序列表中SEQ ID NO.7；所述检测Bcl‑9基因G1106V突变反向引物如序列表中SEQ ID NO.8；所述检测Bcl‑9基因P77L突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.9；所述检测Bcl‑9基因T365I突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.10；所述检测Bcl‑9基因P546R突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.11；所述检测Bcl‑9基因G1106V突变PNA荧光探针如序列表中SEQ ID NO.12；所述肽核酸荧光探针的5'端和3'端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰，修饰所述5'端的荧光报告基团为：FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3'端的淬灭基团为：TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐景峰，陈兴珍，周策凡，张毅，代俊，周梦舟，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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