本发明专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种鉴定单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）的方法。单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计；2）液相PNA分子信标的原位杂交；3）荧光扫描；4）荧光扫描结果的判断。本发明专利技术PNA具有良好的细胞穿透性，与DNA和RNA特异性结合的高稳定性，使本发明专利技术的检测方法具有准确、灵敏的特点。同时将PNA探针结合分子信标标记和荧光扫描技术，在大幅降低假阳性、克服假阴性的情况下大幅提高检测效率，最后用显微镜对阳性样品进行确证，使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。
【技术实现步骤摘要】
单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法
本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种鉴定单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）的方法。
技术介绍
单核细胞增多性李斯特菌是李斯特菌属中人畜共患型的食源性致病菌。感染后常表现为脑膜脑炎、脑炎、骨髓炎、心肌炎、脓血症、流产等，对婴儿及免疫力低下的人群致死率高达54%～90%。该菌在自然界中广泛分布，环境适应性很强，可通过多种途径进入食品加工和生产过程污染食品，对消费者健康构成潜在威胁。肽核酸是1991年由丹麦科学家Nielsen等人设计的一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA模拟物，可以序列特异地与DNA、RNA结合。其骨架为电中性，因此具有很高的DNA或RNA亲和性和良好的细胞穿透性，是核酸探针的良好选择。PNA探针结合原位荧光杂交技术（FISH）与PCR等方法比较，PNA-FISH法的结果判断基于荧光检测和形态检测两部分，较PCR法等假阳性低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步骤。分子信标（molecularbeacon）是一种在5’和3’末端自身形成一个8个碱基左右的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对，因此标记在一端的荧光基团与标记在另一端的淬灭基团紧紧靠近。当荧光基团被激发时，发生荧光共振能量转移，使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和猝灭分子距离增大，信标分子的荧光几乎100%恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。传统的PNA-FISH法检测中，结果的判断单纯依靠显微镜观察，这无疑是一大限速步骤，因此在本专利技术中引入荧光扫描技术，通过仪器对对应波长荧光的扫描可以快速的对检测结果进行初筛，大大提高了检测速率和通量。同时，为了防止由于加入过量探针而引起的假阳性，我们在探针的两头分别标记了荧光基团和淬灭基团，形成分子信标结构。当探针未与目标核酸序列结合时，由于PNA的电中性骨架，无需普通核酸分子信标所需的“茎秆”设计，自然状态下PNA分子信标两头的荧光基团和淬灭基团以自聚集的方式靠近，所激发的荧光都被淬灭基团吸收，因此即便液相PNA荧光杂交液中有过量的游离状态的PNA探针也检测不到荧光，不会产生假阳性。而那些与目标核酸结合的探针，由于探针伸展为线状，造成荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光从而被检测到。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的目的是提供换一种单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，该检测方法具有准确、灵敏的特点。为了实现上述的目的，本专利技术采用了以下的技术方案：单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计在具有单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）特异性的PNA探针的5’端和3’端分别标记报告荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1；2）液相PNA分子信标的原位杂交离心收集对数生长期的细菌，室温固定，固定好的菌体，离心，弃上清,加入PNA分子信标的杂交缓冲液室温下重悬；同时设置两组阴性对照：对照一：不含PNA分子信标的杂交缓冲液重悬；对照二：含RNase和PNA分子信标的杂交缓冲液重悬；将上述重悬菌液、两组阴性对照于薄壁PCR管中加洗涤缓冲液重悬；3）荧光扫描取上述三种的重悬液加入黑色孔板中，将荧光检测系统的吸收光谱和激发光谱调整到相应的波长，进行荧光扫描检测；4）荧光扫描结果的判断将对照二设置为空白，值为0，将扫描后数值大于0的结果判断为阳性；将对照一设置为空白，将扫描后数值大于0，且同时该孔在设置对照二为空白时扫描值又小于0，同时满足上述2个条件的杂交液也判断为阳性；上述的方法不应用于疾病的诊断。作为优选，所述的步骤1）中PNA探针的序列为TAGTACAAAGGGTCG。当然本专利技术涉及的PNA探针并不限于上述的序列。对于现有的单核细胞增多性李斯特菌荧光鉴定所用PNA探针均可以适用。作为优选，所述的步骤2）中离心收集对数生长期的细菌，用含50%酒精/磷酸缓冲液PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在OD600=1.0-1.5,室温固定1小时后置于-20℃保存。作为优选，所述的步骤2）中对照二的制备方法如下：用40µg/mlRNase，pH7.5，重悬，37℃温育1小时，离心2000g，5min，弃上清后加入50µl含300pmole/mlPNA分子信标的杂交缓冲液重悬。作为优选，所述的步骤2）中将重悬菌液、两组阴性对照于薄壁PCR管中，55℃水浴1.0小时,加入200µl洗涤缓冲液，预热至55℃，55℃水浴20min,2000g离心5min，弃洗涤缓冲液，再重复洗涤1次,加110～150µl洗涤缓冲液重悬。作为优选，所述的该方法还包括将步骤4）荧光扫描结果判断为阳性的对应步骤2）中的重悬菌液取2～5µl涂片，风干后荧光显微镜观察荧光亮度及细菌的形态，对结果加以确证。本专利技术由于采用了上述的技术方案，由于PNA具有良好的细胞穿透性，及其与DNA和RNA特异性结合的高稳定性，使本专利技术的检测方法具有准确、灵敏的特点。同时将PNA探针结合分子信标标记和荧光扫描技术，在大幅降低假阳性（使用分子信标探针）、克服假阴性(设置2个空白对照)的情况下大幅提高检测效率，最后用显微镜对阳性样品进行确证，使检测具有分子生物学和形态学的双重保证，更加提高了鉴定的准确率。具体实施方式实施例11.PNA分子信标探针的设计本专利技术将具有单增李斯特菌特异性的PNA探针Lm-16S-2（参见专利ZL201110333423.1）3’端的报告荧光基团——FAM除去，重新在5’端和3’端分别标记报告荧光基团——FAM和淬灭基团——BHQ1，形成具有分子信标结构的探针Lm-16S-mb。探针BacUin-mb是将阳性对照探针BacUin进行两端标记，改造成分子信标PNA探针。探针如表1所示。表1PNA探针探针序列(5’-3’)荧光标记探针位置碱基序列;GenBank号BacUinaCTGCCTCCCGTAGGA-CY3－BacUin-mbCY3-CTGCCTCCCGTAGGA-BHQ2－Lm-16S-2TAGTACAAAGGGTCG-FAM1247-1261;FJ434468Lm-16S-mbFAM-TAGTACAAAGGGTCG-BHQ11247-1261;FJ434468aBacUin为阳性对照探针，能与所有细菌结合；引用自Perry-O'Keefe,H.,Stender,H.,Broomer,A.,Oliveira,K.,Coull,J.,Hyldig-Nielsen,J.J.,2001.Filter-basedPNAinsituhybridizationforrapiddetection,identificationandenumerationofspecificmicro-organisms.JApplMicrobiol90(2):180-189.探针合成和标记由韩国Panagene完成.2、液相PNA荧光原位杂交离心（2000g，5min）收集对数生长期的细本文档来自技高网...
【技术保护点】
单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计在具有单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）特异性的PNA探针的5’端和3’端分别标记报告荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1；2）液相PNA分子信标的原位杂交离心收集对数生长期的细菌，室温固定，固定好的菌体，离心，弃上清, 加入PNA分子信标的杂交缓冲液室温下重悬；同时设置两组阴性对照：对照一：不含PNA分子信标的杂交缓冲液重悬；对照二：含RNase 和PNA分子信标的杂交缓冲液重悬；将上述重悬菌液、两组阴性对照于薄壁PCR管中加洗涤缓冲液重悬；3）荧光扫描 取上述三种的重悬液加入黑色孔板中，将荧光检测系统的吸收光谱和激发光谱调整到相应的波长，进行荧光扫描检测；4）荧光扫描结果的判断将对照二设置为空白，值为0，将扫描后数值大于0的结果判断为阳性；将对照一设置为空白，将扫描后数值大于0，且同时该孔在设置对照二为空白时扫描值又小于0，同时满足上述2个条件的杂交液也判断为阳性；上述的方法不应用于疾病的诊断。
【技术特征摘要】
1.单核细胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信标标记和荧光扫描检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：1）PNA分子信标的设计在具有单增李斯特菌（Listeriamonocytogenes）特异性的PNA探针的5’端和3’端分别标记报告荧光基团FAM和淬灭基团BHQ1；PNA探针的序列为TAGTACAAAGGGTCG；2）液相PNA分子信标的原位杂交离心，2000g，5min，收集对数生长期的细菌，用磷酸缓冲液PBS洗涤一次，离心，2000g，5min，弃PBS，用50%酒精/PBS固定缓冲液重悬，细菌浓度控制在OD600=1.0-1.5,室温固定1小时后置于-20℃保存；取100μl固定好的菌体，离心，2000g，5min，弃上清,加入50μl含300pmole/mlPNA的杂交缓冲液室温重悬，杂交缓冲液pH9.0，20mMTris，100mMNaCl，0.5%（w/v）十二烷基硫酸钠；同时设置两组阴性对照：对照一：用50μl不含PNA探针的杂交缓冲液重悬；对照二：用40μg/mlRNase重悬，RNasepH7...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴姗，张晓峰，吴昺，虞惠贞，李可，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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