本发明专利技术涉及生物技术领域中寄生虫的快速检测技术，公开一组伊氏锥虫缺失RoTat1.2基因变异株的环介导等温扩增（LAMP）检测中的特异性引物。包括两对用于检测伊氏锥虫的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测伊氏锥虫的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。其操作简便、成本低廉，结果易于观察，特异性针对伊氏锥虫中缺失RoTat1.2基因的变异株检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别是用于寄生虫快速检测技术中的一种利用环介导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫缺失RoTatl.2基因的变异株所使用的特异性引物。
技术介绍
伊氏锥虫evans1.)是一种寄生于脊椎动物造血脏器和血液中的血鞭毛原虫，虻、吸血蝇是主要的传播媒介，能引起牛、骡、马、羊和犬等家畜严重的伊氏锥虫病，又称苏拉病，临床主要表现为高热、贫血、黄疸和虫血症、急性者死亡率很高。伊氏锥虫感染还导致机体严重的免疫抑制,往往引发其他机会性疾病,如炭疽、巴斯德菌属感染。苏拉病广泛流行于我国江苏、浙江、安徽、云南、贵州、广东、广西、新疆等二十多个省、市、自治区，动物血清学调查平均阳性率高达5?20%，有的地方耕牛感染率甚至达64.47%，严重危害家畜健康。最近有报道首例人体感染伊氏锥虫的病例，更应引起广泛的重视。 伊氏锥虫感染常用的检测方法包括病原学检查和免疫学诊断，病原学检查主要是镜检和小鼠接种，存在灵敏度不高的缺点，尤其在慢性感染和低虫血期；免疫学诊断方法中的抗体检测特异性不高，不能区分现症和既往感染，而抗原的检测虽然特异性较强，但敏感性不高。为有效控制伊氏锥虫病，需要建立高度敏感、特异和简便的检测技术。聚合酶链反应(PCR)具有极高的灵敏度和特异性，并已应用于多种寄生虫病的诊断，但PCR需要精密仪器的配套使用，无法满足基层和现地检测的需求。 Notomi T等在2000年开发了一种新颖的恒温核酸扩增方法，即环介导等温扩增法(Loop-Mediated Isothermal Amplificat1n, LAMP),其原理是利用 Bst (Bacillusstearothermophilus)大片段DNA聚合酶和根据不同祀序列设计的两对特殊的内引物(FIP由FlC和F2组成；BIP由BlC和B2组成)、外引物(F3和B3)，特异地识别靶序列上的6个独立区域，在等温条件下进行靶序列高效快速扩增。 LAMP技术从2003年开始逐步用于医学检测，目前主要是应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，已有应用环介导等温扩增技术快速检测伊氏锥虫的专利(专利号CN 101892313 B)，该专利是靶向RoTat 1.2变异表层糖蛋白(VSG)基因的，但是目前已知存在有缺失RoTat 1.2基因的变异株，用该方法无法实现对RoTat 1.2基因缺失株伊氏锥虫的检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于环介导等温扩增技术(LAMP)检测缺失RoTat 1.2基因的伊氏锥虫变异株的高灵敏度、高特异性的检测方法，使其操作简便、成本低廉，结果易于观察。 本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的:一种缺失RoTatl.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法，该方法包括以下步骤:(I)提取待测的伊氏锥虫的DNA ； (2)在环介导等温扩增反应体系中扩增靶DNA;步骤I提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中的体积浓度为0.05v/v ;所述环介导等温扩增反应体系的反应条件为:65°C恒温反应60分钟，80°C反应5分钟；环介导等温扩增反应体系各组分及含量为:0.1?0.2μ M的引物F3、0.1?0.2μΜ的引物Β3、1.2?1.6 μ M的引物FIP、1.2?1.6μΜ的引物ΒΙΡ、1.4 ?2.8 mM 的 dNTP、6 ?16mM 的 Mg2+、8U 的链置换 DNA聚合酶BstDNA polymerase、1.0 ?1.6 M 的甜菜喊 betaine、0.1V/V 的 10 X ThermoPol React1n Buffer,溶剂为无菌双蒸水；所述引物F3、B3、FIP、BIP如下: FIP (SEQ ID N0.2): 5’ 一 AGTTCACGTGCCTCCGCTTCAATCAAAGACGAGCGGTTCG — 3’ ； BIP (SEQ ID N0.3): 5’ - TAGCCCGCCGCTGCTAAAATAGCGTATTTTCCCGCTACG — 3’ ； F3 (SEQ ID N0.4): 5’ 一 CTGGCAGAGTCCACGAATT — 3’ ； B3 (SEQ ID N0.5): 5，一 AGATCGGCTCCAGCTTCT — 3，；(3)结果分析。结果分析包括3种方法，方法一:直接观察步骤2反应后的产物是否有白色沉淀，若出现白色沉淀，则该伊氏锥虫为缺失RoTatl.2基因伊氏锥虫变异株；方法二:在步骤2反应的混合液中加入染色剂钙绿黄素(FD)，染色剂FD的体积分数为4%，若出现绿色，则该伊氏锥虫为缺失RoTatl.2基因伊氏锥虫变异株；方法三:在步骤2反应后的混合液中加入溴酚蓝上样缓冲液，溴酚蓝上样缓冲液的体积分数为20%，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为ΙΟΟν，时间为30min，溴化乙锭(EB)染色后在紫外灯下观察，若出现梯度条带，则该伊氏锥虫为缺失RoTatl.2基因伊氏锥虫变异株。 本专利技术的有益效果是:该方法与常规检测方法相比，具有操作简便快速、敏感特异、无需特殊仪器、检测时间比普通PCR短等特点，适合于伊氏锥虫病现场防治人员使用。 【附图说明】 图1是LAMP检测伊氏锥虫的敏感性试验，采用电泳方法检测。I)是DNA标志物DL2000，2)是1ng模板DNA，3)是Ing模板DNA，4)是100 pg模板DNA，5)是阴性对照。从结果可看出，LAMP检测伊氏锥虫的最低检测量是I ng。 图2是LAMP检测伊氏锥虫的特异性试验，采用电泳方法检测。I)是DNA标志物DL2000，2)是伊氏锥虫缺失RoTatl.2的突变株DNA样本，3)是伊氏锥虫正常株DNA样本，4)是疟原虫DNA样本，5)是刚果锥虫DNA样本，6)是活动锥虫(VIVAX) DNA样本，7)是利什曼原虫的DNA样本，8)正常小鼠血液DNA样本，9)阴性对照。从结果可看出，伊氏锥虫缺失RoTatl.2的突变株样本显示为阳性，其他样本均为阴性，表明伊氏锥虫正常株不扩增，且与其他寄生虫无交叉反应。 【具体实施方式】 以下实施例用来解释说明本专利技术，而不是对本专利技术进行限制，在本专利技术的精神和权利要求的保护范围内，对本专利技术作出的任何修改和改变，都落入本专利技术的保护范围。如无特别指明，实验所用的引物由上海生工生物技术有限公司合成；BstDNA聚合酶(购自NewEngland 公司);甜菜碱(Betaine)、Mg2+购自 SIGMA 公司。 实施例一、特异性DNA序列查找:从美国基因数据库一GENBANK检索获得伊氏锥虫变异株JN2118HU表层糖蛋白(VSG)基因序列，登录号为AJ870487.1，针对该保守靶序列进行LAMP引物设计，该特异性靶序列如SEQ ID N0.1 所示。 实施例二、引物的设计LAMP方法中的引物设计是LAMP法实现扩增的关键所在,应用PrimerExplorerV3软件设计引物。LAMP扩增的靶序列长度控制在300bp以下，LAMP最少需要4条引物，分别是正向内引物FIP，由F2区段(与靶基因F2c区段完全互补)和Flc区段(同靶基因3’末端的Flc序列相同)组成；正向外引物F3(与靶基因F3c区段完全互补)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）提取待测的伊氏锥虫的DNA；（2）将步骤1提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中扩增靶；其中，步骤1提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中的体积浓度为0.05v/v；所述环介导等温扩增反应体系的反应条件为：65℃恒温反应60分钟，80℃反应5分钟；环介导等温扩增反应体系各组分及含量为：0.1～0.2μM的引物F3、0.1～0.2μM的引物B3、1.2～1.6μM的引物FIP、1.2～1.6μM的引物BIP、1.4～2.8 mM的dNTP、6～16mM的Mg2+、8U的链置换DNA聚合酶BstDNA polymerase、1.0～1.6 M的甜菜碱betaine、0.1V/V的10×ThermoPol Reaction Buffer，溶剂为无菌双蒸水；所述引物F3、B3、FIP、BIP的序列分别如SEQ ID NO.2~SEQ ID NO.5所示：（3）结果分析：直接观察步骤2反应后的产物是否有白色沉淀，若出现白色沉淀，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；或者在步骤2反应的混合液中加入染色剂钙绿黄素FD，染色剂FD的体积分数为4%，若出现绿色，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株；或者在步骤2反应后的混合液中加入溴酚蓝上样缓冲液，溴酚蓝上样缓冲液的体积分数为20%，在2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压为100v，时间为30min，溴化乙锭（EB）染色后在紫外灯下观察，若出现梯度条带，则该伊氏锥虫为缺失RoTat1.2基因伊氏锥虫变异株。...
【技术特征摘要】
1.一种缺失RoTatl.2基因伊氏锥虫变异株的LAMP检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: (1)提取待测的伊氏锥虫的DNA； (2)将步骤I提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中扩增靶；其中，步骤I提取的DNA在环介导等温扩增反应体系中的体积浓度为0.05v/v ;所述环介导等温扩增反应体系的反应条件为:65°C恒温反应60分钟，80°C反应5分钟；环介导等温扩增反应体系各组分及含量为:0.1?0.2μΜ的引物F3、0.1?0.2μΜ的引物Β3、1.2?1.6 μ M的引物FIP、1.2?1.6 μ M 的引物 ΒΙΡ、1.4 ?2.8 mM 的 dNTP、6 ?16mM 的 Mg2+、8U 的链置换 DNA 聚合酶 BstDNApolymerase、1.0 ?1.6 M 的甜菜喊 betaine...
【专利技术属性】
技术研发人员：陆绍红，陈睿，童群波，孔庆明，郑斌，楼涤，丁建祖，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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