缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法技术

本发明专利技术涉及生物领域，特别涉及蛋白的检测技术，具体为缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述定位方法中通过1）制备靶细胞的切片；2）荧光染色；3）运用激光共聚焦显微镜和/或荧光显微镜对靶细胞中的缺失核定位信号的PML蛋白的荧光强度读取并进一步分析，实现对缺失核定位信号的PML蛋白进行定位甚至定量；本发明专利技术首次提供了缺失核定位信号的PML蛋白的检测方法，该方法不仅可以对其定性、定量，还可以实现立体定位；同阴性对照及正常对照相比，本方法的区分度佳，具有很高的特异性和敏感性；本方法对白血病的早期诊断具有辅助诊断作用，为后期研究缺失核定位信号的PML蛋白奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法
本专利技术涉及生物领域，特别涉及蛋白的检测技术。
技术介绍
急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia,APL)是急性髓系白血病的一个特殊类型，占成人急性髓细胞白血病的10%左右，在FAB分型系统中被定义为M3型，具有发病迅速，致死率高的特点。根据“GallagherRE,LiYP,RaoS,etal.CharacterizationofacutepromyelocyticleukemiacaseswithPML-RARalphabreak/fusionsitesinPMLexon6:identificationofasubgroupwithdecreasedinvitroresponsivenesstoall-transretinoicacid[J].Blood,1995,86(4):1540-1547”一文报道，98%以上的APL患者体内都表达PML-RARα融合蛋白，该融合蛋白的形成干扰了野生型RARα的信号传递和PML及其核体（NBs）的正常结构与功能，在APL的发生发展中起了关键作用。PML-RARα融合蛋白被中性白细胞弹性蛋白酶（NeutrophilElastase,NE）切割成了约53Ku和61Ku大小的两种变异蛋白，即NLS缺失的PML（NLS-）蛋白与NLS-RARα蛋白，详见LaneAA,LeyTJ.NeutrophilElastaseIsImportantforPML-RetinoicAcidReceptorαActivitiesinEarlyMyeloidCells[J].MolCellBiol,2005,25(1):23-33。PML-RARα转染入在早期髓细胞中，很容易发展成为APL白血病细胞，将其转染入晚期髓细胞，结果却不能发展为APL细胞。因此，证明PML（NLS-）蛋白存在于HL-60细胞胞浆中，就能从此角度出发在早期就可以检测出APL，为临床奠定基础。本专利技术是基于上述现有技术，并针对现有技术的不足进行改进专利技术的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种缺失核定位信号的蛋白的定位方法，该方法准确度高，精度高。为实现上述目的，本专利技术的技术方案为：缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，该定位方法借助激光共聚焦显微镜通过制备切片、荧光染色及分析荧光强度值等一系列手段获得了准确度高的定位PML（NLS-）蛋白的方法，具体包括以下步骤：A制备切片取靶细胞涂片，并用甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；B荧光染色对步骤A所得切片封闭处理后，用PML蛋白的特异性抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；C荧光强度的获取和分析在激光共聚焦显微镜的红绿双色荧光通道中，扫描观察用靶细胞制备的切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果;红绿双色荧光通道中,红绿双色荧光通道扫描观察：绿光激发波长488nm，在520nm波长以上观察，红光激光波长是543nm，在580nm波长以上观察。进一步，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，步骤B中，所述PML蛋白的特异性抗体为兔抗人PML多抗，所述荧光二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔二抗多克隆抗体。更进一步，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，步骤B中，所述兔抗人PML多抗来自ABCAM公司，作1:300倍体积稀释，所述荧光二抗源自北京中杉金桥生物技术有限公司，作1:300倍体积稀释。其它公司的同类抗体也可以替代上述公司的抗体，但由于效价不同，需要筛选最佳的稀释比。其中，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法中，设置有实验组、正常对照组；步骤C中，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的2倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白。另外，所述定位方法中，设置有实验组、缺失核定位信号的PML蛋白的标准品组，其中标准品组中的缺失核定位信号的PML蛋白已知；分别读取实验组和标准品组的荧光强度，并通过实验组和标准品组中各自的荧光强度比值来计算实验组中的缺失核定位信号的PML蛋白的含量。优选的，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的X倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白;所述X为56.00±5.50除以24.00±6.10的值。该数值是通过多次试验结果计算而得。X的计算是以表2和表3的数据而来。作为优选的技术方案，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，还设置了激光共聚焦显微镜法的平行试验，所述平行试验为荧光显微镜试验，具体为：将步骤B所得荧光染色切片用核染色液染色，在荧光显微镜下观察，并分析荧光强度。在荧光显微镜下，可以获取平面的细胞图像，并对平面的细胞图形中PML（NLS-）蛋白的荧光强度进行分析。分别从平面的细胞图形和立体的细胞图形中PML（NLS-）蛋白的荧光强度进行采集，可以保证数据的准确定和多面性。在获取实时的细胞图形中PML（NLS-）蛋白的荧光强度之前，作为优选的技术方案，可以用Westernblot法进行预实验，对靶细胞的目标部位蛋白进行提取，利用PML（NLS-）蛋白的特异性抗体对其进行定性定量，定量结果同样可以通过读取荧光强度值来获得；具体为:将靶细胞裂解后提取细胞浆蛋白用Westernblot法检测，所述Westernblot法中，一抗为兔抗人PML多抗，二抗为羊抗兔多抗；用化学发光显影成像，并对印迹进行定量分析。作为优选的技术方案，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述一抗和所述二抗均为1：1000倍体积稀释。作为优选的技术方案，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述Westernblot法中，设置有实验组、正常对照组；对印迹的荧光强度进行定量分析，当实验组印迹的荧光强度平均值为正常对照组印迹的荧光强度平均值的2倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白。另外，还可以通过已知含量的PML（NLS-）蛋白标准品，对待测靶细胞中的PML（NLS-）蛋白进行定量。进一步，所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，当实验组印迹的荧光强度平均值为正常对照组印迹的荧光强度平均值的Y倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白;所述Y为1.5800±0.002除以0.1100±0.002的值。Y值可根据表7或表7所在的实施例进行计算而获得。本专利技术的有益效果在于：1）本专利技术首次提供了缺失核定位信号的PML蛋白的检测方法，该方法不仅可以对其定性、定量，还可以实现立体定位。2）同阴性对照及正常对照相比，本方法的区分度佳，具有很高的特异性和敏感性。3）本方法对白血病的早期诊断具有辅助诊断作用。4）本方法为后期研究缺失核定位信号的PML蛋白奠定了基础。附图说明图1为激光共聚焦显微镜观察不同细胞浆中PML(NLS-)蛋白的表达情况。图2为WesternBlot检测PML(NLS-)蛋白水平的表达，其中①为K562细胞；②为HL-60细胞；③为人正常中性粒细胞。图3为H本文档来自技高网...

【技术保护点】
缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述定位方法为激光共聚焦显微镜法，其特征在于:具体包括以下步骤A制备切片取靶细胞涂片，并用甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片；B荧光染色对步骤A所得切片封闭处理后，用PML蛋白的特异性抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；C荧光强度的获取和分析在激光共聚焦显微镜的红绿双色荧光通道中，扫描观察用靶细胞制备的切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果。

【技术特征摘要】
1.缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，所述定位方法为非治疗和诊断目的的定位方法，所述定位方法为激光共聚焦显微镜法，其特征在于:具体包括以下步骤：A制备切片取靶细胞涂片，并用甲醛进行固定，再对靶细胞进行透膜处理，得切片，所述靶细胞为人未经转染的HL-60，检测部位在HL-60的胞浆中；B荧光染色对步骤A所得切片封闭处理后，用PML蛋白的特异性抗体与切片上的所述靶细胞共孵育，形成复合物，用荧光二抗与所述复合物孵育至充分结合，得荧光染色切片；所述PML蛋白的特异性抗体为兔抗人PML多抗，所述荧光二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔二抗多克隆抗体；C荧光强度的获取和分析在激光共聚焦显微镜的红绿双色荧光通道中，扫描观察用靶细胞制备的切片，每张所述切片选取荧光表达最强的视野观察，视野数具有统计数意义，并由计算机扫描软件分析结果；所述定位方法中，设置有实验组、正常对照组；步骤C中，当实验组切片的荧光强度平均值为正常对照组切片的荧光强度平均值的X倍及以上时，判定为所述靶细胞中存在缺失核定位信号的PML蛋白；所述X为56.00±5.50除以24.00±6.10的值。2.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:步骤B中，所述兔抗人PML多抗来自ABCAM公司，作1:300倍体积稀释，所述荧光二抗源自北京中杉金桥生物技术有限公司，作1:300倍体积稀释。3.根据权利要求1所述的缺失核定位信号的PML蛋白的定位方法，其特征在于:所述定位方法中，设置有实验组、缺失核定位信号的PML蛋白的标准品组，其中标准品组中的缺失核定位信号的PML蛋白已知；分别读取实验组和标准品...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘北忠，朱新瑜，钟梁，王慧，马鹏鹏，高远梅，胡秀秀，张曦，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属永川医院，
类型：发明
国别省市：