一种缺失sfp基因的生防菌及其发酵工艺和应用制造技术

本发明专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌HAB-2，保藏编号为CCTCC M 2015070。其缺失关键的脂肽类合成酶基因sfp基因，但仍能产生表面活性素类物质，这就说明该菌株具有特殊的与众不同的生物合成途径，具有极高的研究价值。该解淀粉芽孢杆菌HAB-2有很强的抑制病原真菌的能力，抑菌谱广泛，能抑制多种病原真菌，抑菌效果好，抑菌率高。进一步研究发现该菌株的发酵液经过简单处理可以直接获得有效成分，并且抑菌有效成分稳定，可以在强酸性和强碱性环境下均有很强的活性，在紫外线照射24个小时抑菌活性不会改变，高温对抑菌有效成分没有影响，并且本生防菌的发酵液对植物的生长具有一定的促进生长的作用。

【技术实现步骤摘要】
一种缺失sfp基因的生防菌及其发酵工艺和应用
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种缺失sfp基因的生防菌及其发酵工艺和应用。
技术介绍
芽孢杆菌是一类产生芽孢的革兰氏阳性菌株，它的分布广泛，生理特征丰富，易于分离和培养，是自然界中重要的微生物菌群，芽孢杆菌可以产生多种抗菌活性物质，包括由非核糖体途径合成的非核糖体肽类抗生素以及由核糖体途径合成的细菌素、酶类及其他活性蛋白类抗菌物质等。168菌株是芽孢杆菌的模式菌株，也是目前研究的最为透彻的菌株，他的全基因组已于1997年测序完成。与野生芽孢杆菌不同的是模式菌株168由于在实验室的长期继代培养，发生了很多的自发突变因而丧失了很多野生型的特点，比如sfp基因的自发突变，使得168菌株丧失了产生脂肽类化合物的能力，因而缺失了抑菌的能力。sfp基因编码的4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶，是芽孢杆菌非核糖体途径合成脂肽类化合物的关键基因。本研究的目标菌株HAB-2经过一系列的前期实验表明：该菌株没有sfp基因，但是通过现代的仪器分析手段我们又在HAB-2发酵液中检测得到了由于sfp缺失而不可能得到的脂肽类物质——表面活性素类物质，这就说明本研究的生防菌HAB-2具有特殊的代谢脂肽类的代谢途径，值得进一步的深入研究。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种生防菌，其缺失sfp基因，但是具有产生脂肽类化合物的能力，具有极高的研究价值。本专利技术的另一目的是提供该生防菌的发酵工艺。本专利技术的再一个目的是提供该生防菌的发酵物活性成分的提取方法，本专利技术的最后一个目的是提供该生防菌的应用。本专利技术的第一个方面是提供一种缺失sfp基因的生防菌，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HAB-2，保藏编号为：CCTCCM2015070。本专利技术第二个方面是提供本专利技术第一个方面所述的生防菌的发酵工艺，将本专利技术第一个方面所述的生防菌接种于液体的溶菌肉汤培养基中，在26～30℃的条件下，50～500转/分钟摇菌1～3天，即得到发酵液。优选地，还包括前处理步骤：先将本专利技术第一个方面所述的生防菌接种于溶菌肉汤培养基上26～30℃下活化培养1～6天。本专利技术的第三个方面是提供本专利技术第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：步骤1，采用本专利技术第二个方面所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；步骤2，无菌发酵液用正丁醇萃取，取萃取液，浓缩除去正丁醇，即得。本专利技术的第四个方面是提供另一种本专利技术第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：包括以下步骤：a，采用本专利技术第二个方面所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；b，无菌发酵液用盐酸调节pH至1.5～3，1～10℃下静置至少3h；c，离心，弃去上清液，取沉淀，即得。本专利技术的第五个方面是提供又一种本专利技术第一个方面所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，包括以下步骤：1)采用权利要求2～3任意一项所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；2)缓慢加入饱和硫酸铵，沉淀蛋白，1～10℃下静置至少3h；3)离心得到沉淀，待沉淀干燥后用1/5～1/20原发酵液体积的、pH值为6～8的Tris-HCl溶解沉淀，即得。本专利技术的第六个方面是提供本专利技术第一个方面所述的生防菌在制备脂肽类抑菌制剂中的应用。本专利技术的第七个方面是提供本专利技术第一个方面所述的生防菌在制备防治植物真菌病害制剂中的应用。其中，所述植物真菌病害为番茄早疫病、西瓜枯萎病、香蕉枯萎病、棉花枯萎病、橡胶炭疽病、橡胶树棒孢霉落叶病、茶轮斑病、芒果炭疽病、和或橡胶褐根病中的一种或多种。本专利技术提供的菌株，经多项分类鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌的一个新种，暂命名为解淀粉芽孢杆菌HAB-2(Bacillusamyloliquefaciens.HAB-2)，已于2015年1月27日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为：CCTCCM2015070，地址为武汉大学内。本专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌HAB-2缺失关键的脂肽类合成酶基因sfp基因，根据现代分离技术与抑菌活性相结合的方法确定了该菌株产生的主要活性成分为表面活性素类物质，这就说明该菌株具有特殊的与众不同的生物合成途径，具有极高的研究价值。本专利技术提供的解淀粉芽孢杆菌HAB-2有很强的抑制病原真菌的能力，抑菌谱广泛，能抑制多种病原真菌，抑菌效果好，抑菌率高，这在以往研究中未见报道。进一步研究发现该菌株的发酵液经过简单处理可以直接获得有效成分，并且抑菌有效成分稳定，可以在强酸性和强碱性环境下均有很强的活性，活性不会受到影响，在紫外线照射24个小时抑菌活性不会改变，高温对抑菌有效成分依然没有影响，并且本生防菌的发酵液对植物的生长具有一定的促进生长的作用。附图说明图1本专利技术的生防菌的功能基因的特异PCR检测结果，其中，1：HAB-2菌株，A：:枯草芽孢杆菌鉴定序列(Bsu-man)1287bp，B：地衣芽孢杆菌鉴定序列(Bli-man)1278bp，C：解淀粉芽孢杆菌鉴定序列(Bam-man)1275bp，M：2000bpMarker。图2为本专利技术的生防菌在不同培养基上的菌落形态，其中，A：AYBA培养基，B：BPY培养基，C：LB培养基，D：NA培养基，E：基础培养基，F：发酵培养基。图3为菌株HAB-2和168菌株抗生素合成相关基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，A：ituC，B：srfAB，C：fenD，D：ituB，M：2000DNAmarker。图4为菌株HAB-2与芽孢杆菌模式菌株168脂肽类关键合成酶基因的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图，其中，M：2000Marker，A：HAB-2-ituA基因，B：B.S168-ituA基因，C：HAB-2-ituD基因，D：B.S168-ituD基因，E：HAB-2-lpa14基因，F：B.S168-lpa14基因，G：HAB-2-sfp基因，H：B.S168-sfp基因，I：HAB-2-mycB基因，J：B.S168-mycB基因，K：HAB-2-fenB基因，L：B.S168-fenB基因。图5为菌株HAB-2与B.S168菌株抑菌试验结果。图6为HAB-2的抑菌物质的抑菌活性检测结果，其中，A为正丁醇过凝胶测活结果：1正丁醇(23.08mm)，2正丁醇凝胶测试有活性2号(12.12mm)，3凝胶测试有活性3号(15.78mm)；B为正丁醇抽柱测活结果：4抽柱有活性甲醇冲柱，5抽柱氯仿甲醇1∶1；C为正丁醇抽柱测活结果：抽柱其他馏分无活性；D为脂肽类凝胶柱测活结果：6脂肽类(14.77mm)，7脂肽类有活性2号(11.09mm)。图7为HAB-2的抑菌物质的TCL检测结果，框部分为有活性的部分，其中，1正丁醇，2正丁醇凝胶测试有活性2号，3凝胶测试有活性3号，4抽柱有活性甲醇冲柱，5抽柱氯仿甲醇1∶1，6脂肽类，7脂肽类有活性2号。图8为本专利技术的生防菌的对部分植物病原真菌的抑菌试验检测结果的照片，其中，A：橡胶炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)，B：芒果炭疽病1号(Colletotrichumgloeosporioides本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种缺失sfp基因的生防菌，其特征在于，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HAB‑2，保藏编号为：CCTCC M 2015070。

【技术特征摘要】
1.一种缺失sfp基因的生防菌，其特征在于，为解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)HAB-2，保藏编号为：CCTCCM2015070。2.一种权利要求1所述的生防菌的发酵工艺，其特征在于，将权利要求1所述的生防菌接种于液体的溶菌肉汤培养基中，在26～30℃的条件下，50～500转/分钟摇菌1～3天，即得到发酵液。3.根据权利要求2所述的发酵工艺，其特征在于，还包括前处理步骤：先将权利要求1所述的生防菌接种于溶菌肉汤培养基上26～30℃下活化培养1～6天。4.一种如权利要求1所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，采用权利要求2～3任意一项所述的发酵工艺制得发酵液，然后离心除去菌体，得到无菌发酵液；步骤2，无菌发酵液用正丁醇萃取，取萃取液，浓缩除去正丁醇，即得。5.一种权利要求1所述的生防菌的发酵物活性成分的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：...

【专利技术属性】
技术研发人员：缪卫国，靳鹏飞，刘文波，郑服丛，王皓楠，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南;66