一种新的快速定量检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法以及胶体金免疫检测试纸条技术

本发明专利技术建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特异、准确地检测样品中的单增李斯特菌，并可实现定量，适用于现场快速检测。本发明专利技术属于生物检测领域，具体涉及单增李斯特菌的检测快速定性和定量检测方法以及胶体金免疫检测试纸条。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体涉及单增李斯特菌的检测快速定性 和定量检测方法以及胶体金免疫检测试纸条。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(Listeria mo跳ytogenes，单增李斯特菌)， 是李斯特菌属(Listeria)中最重要的人类食源性病原菌，也是一种人畜 共患的致病菌，属李斯特菌属，它可引起人和动物患脑膜炎、脑炎、败 血症、心内膜炎、流产、死胎及脓肿等，发病者死亡率可达30%—40%。近 年来已有不少国家报道了由于污染单增李斯特菌发生的食物中毒事件。 因此，世界各国政府部门对单增李斯特菌引起的食物中毒越来越重一见， 纷纷制定了一些新的食品安全法规，并"fe单增李斯特菌纳入法定强^r项 目。目前单增李斯特菌的检测方法主务农靠传统的分离养(参见吴清 平等."单核细胞增生李斯特菌检测技术研究进展"，J .中国卫生枱二-睑 杂志，2005 ，15 (7) :888 - 890; Robin L T Churchill ， Hung Lee ，et al. " Detection of Listeria mono2 cytogenes and the toxin 1 isteriolysin 0 in food" J .Journal of Mi 2 crobiological Methods, 2006 ，64:141 - 170.)和生化鉴定，该方法费时费力。月交体 金快速诊断试纸条技术是20世纪90年代以来发展起来的一项新型体 外诊断技术(参见李永勤，杨瑞馥."以膜为固相载体的免疫胶体金快 速试验"，J .微生物学免疫学进展，2003 ,31 (1) :74 - 78.)。近年 来该方法发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应 用，但用于食品卫生领域检测的产品较少。本研究针对单增李斯特菌研 制出了食品污染单增李斯特菌的免疫胶体金检测试纸条。本研究建立的 胶体金检测方法灵敏、准确、特异性强，可进一步应用到检验检疫部门对进出口食品中单增李斯特菌的检测实际工作中。此方法建立后，可与 经典常规方法互补，预计将在检验检疫、食品工业部门及卫生监控部门 具有较广的应用前景，有一定的经济和社会效益。同时，可为食品樣吏生 物检验国际方法的修订或增补提供科学依据。
技术实现思路
单增李斯特菌在美国被列为7种主要的食源性致死病菌之一 ，WHO 食品安全工作计划已将其列为重点检测的食源性病菌之一 。即食食品4艮 容易被单增李斯特菌污染，这就要求及时对即食食品批量的快速检测。本专利技术涉及一种胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌的 方法及其产品。本专利技术的方法利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析4支 术，建立单增李斯特菌的快速检测方法，评价其特异性和敏感性，并扣乂 合检测曲线进行定量检测；在奶粉、牛奶、火腿肠等食品样品中添加单 增李斯特菌模拟污染样品，评价该方法对固体、半固体、液体等食品、 可疑生物恐怖样品的检测能力。本专利技术的方法可在15min内完成定性和 半定量检测，灵敏度为lng/ml，线性范围105cfu/ml—108cfu/ml、回4欠 率98%—101%。该法特异性、稳定性良好，可对样品直接进行检测。本发 明建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法，能快速、灵敏、特 异、准确地检测样品中的单增李斯特菌，并可实现定量，适用于现场'决 速检测。一种检测单增李斯特菌的方法，其中包括将待测标本与样品稀释、液 混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用 上行，10-15分钟判读结杲；所述试纸包括(U反应支持物；(2 )吸水垫；(3 )硝酸纤维膜，该膜包被有单增李斯特菌抗体和质控抗体的4企测 条带和质控条带；(4 )金标抗体垫，其中含有胶体金标记的单增李斯特菌P60抗体；(5 )样品垫；其中单增李斯特菌抗体可以是多克隆抗体，也可是单克隆抗体；质5控抗体可选自羊抗兔、鼠抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的IgG。本专利技术方法中所述的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标抗体垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样 品垫的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本专利技术方法中所述的试纸，其中吸水垫、金标抗体垫、反应支持物、 硝酸纤维膜和样品垫按照附图1所示方式构成；反应支持物5位于底yg, 硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，该膜的T处是单增李斯特菌 P60多克隆抗体包被的检测条带，并且C处是羊抗兔IgG包被的质控条带； 玻璃纤维膜3位于硝酸纤维膜上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有月交 体金标记的单增李斯特菌P60多克隆抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2 上部的相对于玻璃纤维膜3而言的另一側并与2部分重叠。样品垫4位 于2上与1相反的一侧并与3部分重叠。本专利技术方法中所述的试纸，其中吸水垫一侧为起始端，玻璃纤维膜 一側为末端，检测抗体的条带位于接近末端，质控条带接近于起始端。本专利技术方法中所述的试纸，其中所述抗单增李斯特菌的抗体可以是 多抗，也可是单抗；质控抗体根据金标抗体的免疫源可选4奪羊抗兔、鼠 抗兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠等 的IgG。本专利技术方法中所述的试纸，其中所述抗单增李斯特菌P60多克隆抗 体的浓度为0. 5-5mg/ml。质控抗体浓度为0.1-2 mg/ml。所述抗单增李 斯特菌P60抗体标记lml胶体金的量为5-20ug。本专利技术所述的单增李斯特菌的检测试纸的制备方法，该方法包括 (1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗单增李斯特菌抗体和 ;质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；(2 )制备一种含有胶体金标记的抗单增李斯特菌抗体的玻璃纤维 膜，将胶体金标记的抗单增李斯特菌抗体均匀涂布在玻璃纤维膜上，并 供干或冷冻干燥。本专利技术所述的试纸在检测单增李斯特菌中的应用，其中包括将待测 > 标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的 液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。本专利技术还提供由所述的方法制备的检测单增李斯特菌的试纸。本专利技术所述方法中采用抗原及抗体，其中单增李斯特菌例如是Listeria monocytogenes,菌号19111，可购自卫生部药品生物制品检定 所；单增李斯特菌P60多抗例如是Listeria monocytogenes, multiple cloning antibody of P60，可购自吉4木省枱r'睑4企疫局；羊抗兔IgG可购 自鼎国生物技术公司。此处与抗原结合的可以是多抗，也可以是单抗， 只是本实验所选用的是P60多抗，来自吉林局；而此处净皮;险测物体是菌 液，而不是抗原，只是利用了抗原抗体特异性结合的原理，被检测物体 可以是其他单增李斯特菌抹，本实验采用的是我们检科院其中一林单增 李斯特菌，菌号是19111。本专利技术的产品和方法中使用层析测试条耗材，例如结合垫(玻璃纤 维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF 1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸，购 自Minipore公司。根据检测试纸，其中吸水垫选用滤纸，反应支持物选用PVC板，金标 抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，样品垫的材料选 自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。本专利技术使用的实验仪器例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测单增李斯特菌的方法，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，１０－１５分钟判读结果；所述试纸包括：　（１）反应支持物；　（２）吸水垫；　（３）硝酸纤维膜，该 膜包被有单增李斯特菌抗体和质控抗体的检测条带和质控条带；　（４）金标抗体垫，其中含有胶体金标记的单增李斯特菌Ｐ６０抗体；　（５）样品垫；　其中，单增李斯特菌抗体可以是多克隆抗体，也可是单克隆抗体；质控抗体可选自羊抗兔、鼠抗 兔、人抗兔、兔抗羊、鼠抗羊、人抗羊、羊抗鼠、人抗鼠、兔抗鼠的ＩｇＧ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王静，王振国，谢士嘉，杨宇，姚李四，孙肖红，胡孔新，张晓龙，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]