本发明专利技术公开了了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤：1）首先选择5条上游引物和1条下游引物；2）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4）取扩增后的产物进行电泳；5）结果判定。本发明专利技术是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高了效率，节约时间，而且节省检测成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法。
技术介绍
目前国际上公认的李斯特菌共有6种单核细胞增生李斯特菌(lis teria mwocj^ow/ ^，简称单增李斯特菌)、绵羊李斯特菌(listeria ivanovii)、英诺克李斯特菌(Listeria innocua)lif {Listeria welshimeri)lif {Listeria grayi)和西尔李斯特菌(listeria seeligcri).其中单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，可引起严重的传染病，如败血症、脑炎、脑膜炎。该菌广泛存在于自然界中，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是单增李斯特菌的感染源，食品中存在的单增李斯特菌对人类的安全具有威胁，该菌在4 ！的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原之一，2000年被WHO食品安全工作计划列为检测的食源性致病菌之一； 绵羊李斯特菌主要危害动物，特别是反刍兽，常表现为败血症和流产，对人危害较少；英诺克李斯特菌在近期国内外报道存在食品中，对人类具有一定的潜在致病性。尤其在发生由非溶血性变为溶血性的变异时，有致病的潜力；其余3种李斯特菌对人和动物的危害相对较小。英诺克李斯特菌、威尔李斯特菌、格氏李斯特菌等李斯特菌虽不是常规致病菌，但由于其常与致病的李斯特菌共同存在于食品中，因此也被作为致病李斯特菌的指示菌。在食品中，虽然不同李斯特菌的危害严重性不同，但任何一种李斯特菌的存在，均被认为是卫生状况不良的指示。从上世纪80年代起，美国、日本、新西兰、德国、英国、法国、欧洲等国家多次因食品污染爆发人类李斯特菌病。至2003年，我国有报道的散发性李斯特菌病例150例，死亡率269L 2008年，加拿大共发生57起李斯特菌感染，造成23人死亡。目前，鉴定李斯特菌的方法主要分为两类一类是传统的生化鉴定方法，包括微量生化反应方法和血清学方法等。另一类是分子生物学方法，包括普通PCR方法和实时荧光 PCR方法等。传统方法费时、费力，且实验重复性相对较低，但其准确性使很多国家在制定标准时依然采用传统方法。分子生物学方法鉴定细菌具备快速、简便的特点，但在准确性和特异性方面尚有需要改进之处。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法；本专利技术是一种快速、准确、灵敏的多重PCR检测和鉴定5种李斯特菌的方法，为分子生物学方法鉴定李斯特菌种提供选择。不仅提高效率，节约时间，而且节省检测成本。为了达成上述目的，本专利技术的解决方案是一种多重PCR快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，包括如下步骤1)首先选择5条上游引物和1条下游引物；2)取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板；3) 分别在阳性对照标准菌液制备的基因组DNA模板和待检菌液制备的基因组DNA模板中添加所述上游引物和下游引物进行PCR扩增反应；4)取扩增后的产物5 μ L点样于1%琼脂糖凝胶，其中含0. 5 μ g/mL溴化乙锭，以2000 bp Marker为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；5)结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出230 250 bp 条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出650 660 bp条带的， 判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出460 470 bp条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出360 370 bp条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出860 870 bp条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。所述的5条上游引物和1条下游引物的引物序列分别为 上游引物 MonoA 5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3 ；上游引物 Ino2 5' -ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3，； 上游引物 WelD 5' -ACAGTAATACAACTGCACCAA-3'； 上游引物 Gral :5，-AATCAAGTAGGTCTTAGCCTTTCTG-3，； 上游引物 IvaA 5' -TAGCAGCACGGCAAGCGCAA-3'； 下游引物 IislB :5，-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3，。所述的PCR 反应条件如下95 °C变性 3 min ；95 "C 15 s、58 "C 30 s、72 "C 45 s, 进行30个循环扩增；72 °C延伸5 min。所述PCR反应体系如下IOX扩增缓冲液5 μ 1 ；(购于FERMENTAS)4种dNTP混合物各200 μ mol/L ；引物各 0.5 μ mol/L ；DNA 模板2 μ g ；Taq DNA聚合酶2 u ；(购于生工生物工程(上海)有限公司)MgCl21. 5 mmol/L ；力口 ddH20 至50 μ 1 ；其中所述的4种dNTP混合物指三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，脱氧胸苷三磷酸 dTTP，脱氧鸟苷三磷酸三钠dGTP，脱氧胞苷三磷酸dCTP。(购于Bio Basic Inc)所述的扩增缓冲液配方为:pH 8.8，25°C，100 mM Tris-HCl ；500 mM, KCl ；0.8%(ν/ν), 乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P40)。 所述的阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组DNA模板的方法为取5种李斯特菌(ATCC33090英诺克李斯特菌，CMCC54002单核增生李斯特菌，ATCC19119绵羊李斯特菌，ATCC35897威尔李斯特菌，ATCC25401格氏李斯特菌) 的标准菌株细菌培养液1 ml (购于上海复祥生物公司)或者是待检菌液1 ml，置于无菌的 1.5 ml Eppendorf离心管中，12000 rpm离心1 min，去上清，用灭菌蒸馏水洗涤两次，收集菌体；加入400 μ 1裂解液混勻，置于37 °C水浴1 h;然后加入200 μ 1 5 mol/L的氯化钠溶液，混勻后于13000 rpm离心15 min ；取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次；加两倍体积无水乙醇，1/10体积，3 mol/L，pH8. 0的醋酸钾，-20 °C保存1 h后，13000 rpm离心 15 min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50 μ 1 TE溶液(购于上海索莱宝生物科技有限公司)中，置4 °C保存备用。所述的裂解液配方为40 mmol/L Tris-醋酸，20 mmol/L醋酸钠，1 mmol/L EDTA, 1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH7.8。 本专利技术的有益效果为本专利技术建立了利用多条引物5竞争性退火的多重PCR方法检测和鉴别5种李斯特菌的方法，并经实际样本检测测试，未发现假阳性结果，表明该方法切实可行。本方法采用PCR扩增技术，使得检测5种李斯特菌的灵敏度大大提高。由于本方法经一次PCR即可鉴别5种李斯特菌，不需要对每种李斯特菌分别进行确证鉴定，节省了实验时间，加快了检出速度。综上所述本专利技术的李斯特菌检测和鉴定方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，较传统的生理生化鉴定方法具有更高的可重复性，较普通PCR更为快速、简便，可实现对5种李斯特菌的快速、准确、特异的本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种多重ＰＣＲ快速检测和鉴定五种李斯特菌的方法，其特征在于包括如下步骤：１）首先选择５条上游引物和１条下游引物；２）取阳性对照标准菌液和待检菌液分别制备基因组ＤＮＡ模板；３）分别在阳性对照标准菌液制备的基因组ＤＮＡ模板和待检菌液制备的基因组ＤＮＡ模板中添加所述上游引物和下游引物进行ＰＣＲ扩增反应；４）取扩增后的产物５ μＬ点样于１％琼脂糖凝胶，其中含０．５ μｇ／ｍＬ溴化乙锭，以２０００ ｂｐ Ｍａｒｋｅｒ为标准分子参照，进行电泳；电泳结果用紫外凝胶成像系统分析；５）结果判定，待检样品与阳性对照同时扩增出２３０～２５０ ｂｐ条带的，判定为格氏李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出６５０～６６０ ｂｐ条带的，判定为单增李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出４６０～４７０ ｂｐ条带的，判定为威尔李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出３６０～３７０ ｂｐ条带的，判定为绵羊李斯特菌阳性；待检样品与阳性对照同时扩增出８６０～８７０ ｂｐ条带的，判定为英诺克李斯特菌阳性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭书林，陈信忠，龚艳清，孔繁德，杨俊萍，陈垚，徐淑菲，叶妍妍，
申请(专利权)人：厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：92
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