本发明专利技术涉及一种利用靶分子与其适体之间的特异性识别的性质，构建的基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌快速超灵敏检测器。本发明专利技术还涉及将经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜作为电极，组装自制电解池；铁氰化钾离子作为探针离子，对单核增生李斯特菌进行检测的方法。当LM存在且浓度较低时，电流升高值随其浓度的增加显著下降；随LM浓度的增加，电流变化值下降；LM浓度在100‑1250CFU/mL范围内时，与电流升高值之间呈线性关系；当其浓度大于1500CFU/mL时，电流变化值趋于稳定。因此，该检测方法对LM的最低检测限可达100CFU/mL，线性范围100‑1250CFU/mL，可在10分钟内完成检测。经108CFU/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对照实验，表明其对李斯特菌具有高度选择性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种利用靶分子与其适体之间的特异性识别的性质，构建的基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测器。本专利技术还涉及将经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜作为电极，组装自制电解池；铁氰化钾离子作为探针离子，对单核增生李斯特菌进行快速、灵敏检测的方法。
技术介绍
单核细胞增生李斯特菌(学名：Listeria monocytogenes)，是一种兼性厌氧细菌，为李斯特菌症的病原体；是革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。单核细胞增生李斯特菌(以下均简称LM)是一种人畜共患病的病原菌。它与大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌一起被世界卫生组织列为四大食源性致病菌。李斯特菌病就是由单核细胞增生李斯特氏菌引起的一种罕见却严重的疾病。这种病原菌能在正常的烹饪温度下被杀死，也能在冷藏温度低至0℃的条件下缓慢生长。大多数健康的人可能会发生没有表现出临床症状但被感染李斯特菌的情况，但是一些易感人群，例如孕妇、老年人和免疫力低下的人(如艾滋病患者、糖尿病患者等)，会面临十分严重的健康危险。食品中的LM的存在可能是源于其成分(特别是原材料)或者来自于周围的环境，包括设备，成品和原材料之间的交叉污染。如果在温度等环境条件，尤其是酸度和水分含量的允许下，LM可以通过长期贮存的过程大量繁殖生长。LM的生长对于环境的要求不高，不管有氧还是缺氧的环境都可以；其生长的温度范围比较广范，但是它的最适生长温度为37℃，在4℃时生长就比较缓慢，-18℃时可以存活；耐高盐且耐酸性强：20％的氯化钠、pH值的范围为4.4～9.6的条件下都可以生长；在氧分压略低、二氧化碳压力略高的条件下生长良好。这些性质导致了LM在自然环境中几乎无处不在。因为LM是最致命的食源性病原菌之一，可以造成20～30％的临床感染者死亡，所以，对LM的检测有很大的必要性。目前，LM的检测方法有很多，可以分为以下几种：①传统的分离与鉴定的方法；②显色培养基的快速鉴定技术；③全自动微生物分析系统④分子生物学的方法；⑤免疫学方法等。食品中的李斯特菌的传统检测方法有3个主要环节：增菌、分离、鉴定，整个过程中有一系列的生化反应和其它实验。这个方法不仅耗时还特别繁琐。显色培养基的快速鉴定技术则是针对LM的葡萄糖苷酶和毒力因子。全自动微生物分析系统是微生物检测的发展方向之一，它的过程则比较简单、便捷，且准确率比较高。然而在LM的检测过程中，如果被检测样品中的目标细菌的数量比较少，这使得检测有一定的难度。通过人们的努力，基于核酸基础的分子生物学检测方法出现了。这个方法通过扩增少量目标细菌的特定基因信号而完成检测，可以达到李斯特菌属或种的水平上的检测。聚合酶链式反应(PCR)在食品检测中的应用使得它不仅可以利用DNA分子，还可以用RNA分子。这些探针试剂盒的检测速度快且检测结果准确。免疫学的检测方法是基于抗体对于抗原之间的自然亲和力，但这个检测方法所需要的样品是必须经过纯化才能准确的检测出LM。然而它和PCR检测相比，聚合酶链式反应的检测结果更加容易受样品的影响。这种检测方法是很快速和准确的，且操作过程比较简单。不过，它的不足就是灵敏度低、特异性差。因此，希望研究出一种对于LM的检测更加准确、更加灵敏和更加便捷的方法。新兴的纳米材料因其特殊性质被关注而加以运用。张广腾等人利用金纳米颗粒的玻碳电极固定巯基修饰的DNA探针于其表面，制备了检测LM的电化学生物传感器。这个方法的最低检出限达到了1.0×10-12mol/L(DNA浓度计)。钟子清等人利用经表面修饰的纳米免疫磁珠对检样中的LM进行富集，在磁场作用下被吸附分离以消除干扰因素；从而提高了检测灵敏度，达到高检出率并缩短了检测时间。本专利技术使用经LM适体修饰的多孔氧化铝膜纳米材料作电极，对LM进行电化学检测。金属铝化学性质活泼，易被氧化而在铝表面形成一层致密的氧化铝膜层。氧化铝膜层较稳定，能防止内部的铝继续被氧化，对铝起到保护作用。经研究，氧化铝膜层是纳米多孔结构，能够保持固定的形状和结构特征。将铝加入一些酸性介质中作为阳极进行电化学反应，生成多孔氧化铝膜，又称多孔阳极氧化铝膜(porous aluminium oxide film，简称PAA膜)。PAA膜具有六角的微孔，形成特别的、自组织的高度有序的纳米阵列结构；这些微孔垂直于铝基体。微孔的直径随着阳极氧化条件的变化发生改变。根据不一样的氧化条件，微孔的直径可以在10～500nm之间变化。随着人们对PAA膜的微观结构和性能的了解和认识，PAA膜逐渐被大量用作传感器材料、分离膜材料、抗菌膜材料、催化材料、光学及光电元件、磁性记录材料等等。本专利技术使用PAA膜作电化学检测中的传感器基体元件。适配体传感器是生物传感器的一种。生物传感器涵盖了生物、化学和信号处理等技术，具有高度的特异性、准确度和精密度。它分为很多种类：适配体传感器、微生物传感器、免疫传感器和酶传感器等等。在食品的安全检测方面，适配体传感器的应用越来越被人们关注了。本专利技术使用适配体传感器进行实验。适体是一段单链DNA或者RNA寡聚核苷酸链，能够特异性结合具有高亲和力的靶细胞。与抗体相比，适体具有极大的潜力。高亲和力的抗体的生产是昂贵且费时的。因此，对于任何一个目标分子的抗体的制备都是不容易的。但亲和力高，特异性高，稳定性高，简单的标记，PCR定向扩增核酸和低成本生产等都是适体相对于抗体的优势方面。在对目标分子的进行识别的过程中，核酸适体有比较明确的三维结构。自从1990年第一个适体被发现后，不同类型的适体已经在体外进行了评估，有蛋白质、毒素、ATP，甚至病毒和细胞表面标志。因此，由于其高度的选择性和灵敏度，基于几乎所有类型的适体的生物传感器和纳米生物传感器已被广泛研究。本专利技术中所使用的适体是DNA适体。它是一段DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中“5′”端修饰了一个醛基(5′-CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3′)以便于将其固定在多孔氧化铝膜的纳米通道内表面。此适体可以通过体外人工合成、方法简单；可以进行靶向识别；与LM有高度的亲和力；有极高的选择性。这也是适配体传感器一个重要的优势。因此，本专利技术方法能准确，简单，高度适宜地检测LM。
技术实现思路
本专利技术涉及基于纳米通道限域特性的单核增生李斯特菌超灵敏检测器，制备该检测器的方法，以及该检测器对单个单核增生李斯特菌进行检测的用途。一方面，本专利技术提供了经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜电极为表面经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜，并且在其另一面镀金。具体地，所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。更具体地，所述DNA适体是DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中“5′”端修饰了一个醛基(5′-CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3′)。另外，更具体地，所述镀金是通过使用真空离子溅射仪实现的。另一方面，本专利技术提供了制备上述多孔氧化铝膜电极的方法，所述方法包括：(1)将本文档来自技高网...
【技术保护点】
经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜电极为表面经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜，并且在其电极的外侧面镀金。
【技术特征摘要】
1.经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜电极为表面经单核增生李斯特菌的DNA适体修饰的多孔氧化铝膜，并且在其电极的外侧面镀金。2.根据权利要求1的多孔氧化铝膜电极，其中所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。3.根据权利要求1或2的多孔氧化铝膜电极，其中所述DNA适体是DNA单核苷酸链，有47个氨基，其中“5′”端修饰了一个醛基(5′-CHO-ATC CAT GGG GCG GAG ATG AGG GGG AGG AGG GCG GGT ACC CGG TTG AT-3′)。4.根据权利要求1-3中任一项的多孔氧化铝膜电极，所述镀金是通过使用真空离子溅射仪实现的。5.制备权利要求1的多孔氧化铝膜电极的方法，所述方法包括：步骤(1)：将多孔氧化铝膜逐步清洗、煮沸、浸泡以修饰官能团；步骤(2)：用真空离子溅射仪在多孔氧化铝膜一面镀金、过塑制成膜电极；步骤(3)：将与单核增生李斯特菌特异性结合的适体修饰在多孔氧化铝膜的纳米通道表面上。6.根据权利要求5的方法，所述多孔氧化铝膜的孔径为20nm。7.根据权利要求5或6的方法，其中，在步骤(1)中，使用30％的过氧化氢来修饰羟基；使用3-氨丙...
【专利技术属性】
技术研发人员：李承勇，周浓，周春霞，王娟，
申请(专利权)人：广东海洋大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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