驼背海马、三斑海马和克氏海马的荧光PCR检测方法及其引物和探针技术

本发明专利技术提供了一种针对驼背海马，三斑海马和克氏海马的实时荧光PCR检测方法。基于具有高度物种特异性的驼背海马，三斑海马，克氏海马线粒体细胞色素氧化酶亚基I序列设计了具有物种特异性的引物和探针，实现以Real

【技术实现步骤摘要】
驼背海马、三斑海马和克氏海马的荧光PCR检测方法及其引物和探针


[0001]本专利技术属于生物技术鉴定领域，特别涉及驼背海马，三斑海马和克氏海马的实时荧光PCR检测方法。

技术介绍

[0002]海马是珍贵的药材，在中国等亚洲国家深受消费者喜爱。目前海马属内54种海马全部列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附II，同时海马属也被列入我国国家二级重点保护动物名录。驼背海马(Hippocampus camelopardalis)，三斑海马(Hippocampus trimaculatus)和克氏海马(Hippocampus kelloggi)均属于海马属(Hippocampus spp.)海龙鱼目(Syngnathiformes)海龙科(Syngnathidae)动物。受到经济利益驱使，市场上的海马贸易也并未绝迹，近3年本实验室检测鉴定的由海关截获送检的海马样本就高达190多批次。对濒危动植物的精准鉴别是对濒危物种开展保护的最基本手段。
[0003]传统的海马鉴别方法主要依赖外部形态特征，但这往往需要鉴定人员具有丰富的经验。此外，市场上销售的海马，不仅仅以海马完整的形态展示，往往还会涉及海马胶囊，海马口服液等形态不完整的海马产品，因此单纯从形态上比较难鉴别。现代分子生物学的鉴别方法可有效克服上述形态学鉴定方法的不足，同时也比物理学的光谱结构分析法，及化学的内含物质结构分析法更加稳定可靠。
[0004]CN104017899A公开了“海马的鉴定方法”为基于DNA条形码的特异引物PCR技术。PCR引物由两组FISH的通用引物组成，鉴定方法包括以下步骤：提取海马总DNA，进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，扩增产物进行测序，序列比对后确定海马种类。该方法采用普通PCR方法，该反应时间较长，且反应液必须经过琼脂糖凝胶电泳检测后测序比对才能得到实验结果。电泳需要荧光素染色，大多数的荧光色染料都具有毒性。同时，电泳法检测特异性不太高，引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判，此外特异引物常规PCR扩增的产物进行检测时，样品间可能产生交叉污染，从而引发假阳性问题。因此，需要研究一种灵敏、快速和特异性的鉴定海马的实时荧光PCR方法。

技术实现思路

[0005]针对海马形态学鉴定的局限性，以及普通PCR方法在检测技术中存在的缺点，本专利技术提供了一种针对驼背海马，三斑海马和克氏海马快速、灵敏的定性检测鉴定方法，可用于海马和海马制品真伪鉴别。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案。
[0007]本专利技术提供了一种实时荧光PCR实时荧光检测驼背海马、三斑海马和克氏海马的方法，包括以下步骤。
[0008](1)样本DNA提取。取0.2g海马样品，振荡研磨仪中充分研磨成粉状后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在30μL
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100μL水中(可根据浓
度需要进行调节)。DNA浓度和纯度通过NanoDrop 1000超微量分光光度计在260nm和280nm波长处进行测定。(2)实时荧光PCR扩增检测。引物探针序列如表1所示。实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取的DNA液2μL，用水补足体积至20μL。应用荧光定量PCR仪lightcycle480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。
[0009](3)结果判定。驼背海马和三斑海马：Ct值小于等于37时，结果为阳性，Ct值大于37时为阴性；克氏海马：Ct值小于等于38时，结果为阳性，Ct值大于38时为阴性。
[0010]表1 Real
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Time PCR的引物和探针
[0011][0012][0013]F：上游引物；R：下游引物；P：探针.
[0014]*引用自GB/T25165
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2010。该引物探针可作为内参照引物探针，检验所抽提DNA的质量。
[0015]本专利技术还提供了一种对驼背海马、三斑海马和克氏海马进行实时荧光PCR检测的试剂，包括如表1所示的引物和探针。
[0016]本专利技术的有益效果包括以下几个方面。
[0017]1.采用本专利技术驼背海马、三斑海马和克氏海马鉴定用引物和探针及鉴定方法对海
马进行鉴定，所用时间短，仅2～3个小时即可鉴定结果，相较于普通PCR操作简单，结果判定直观清晰，只要读取Ct值即可判断。同时可省去普通PCR测序的时间和费用。
[0018]2.本专利技术海马的鉴定方法不涉及氯仿、溴化乙锭等有毒试剂，极大保护鉴定人员的健康。
[0019]3.本专利技术可解决混合驼背海马、三斑海马和克氏海马干和海马制品中的成分鉴定，检测特异性好，灵敏度高，检测浓度低至0.0012ng/μL。而现有分子生物学检测方法(普通PCR法)不能将混合海马干制品中的驼背海马、三斑海马和克氏海马成分同时检测出，而且检测灵敏度低，检出率受限于DNA浓度。
[0020]具体实施案例
[0021]实施实例1：引物和探针的设计
[0022]基于具有高度物种特异性的驼背海马，三斑海马和克氏海马线粒体COI基因序列(GenBank:GQ502127.1，MH346193.1，MF123923.1)，设计出扩增上述基因片段的特异性引物和荧光探针若干组。将设计得到的引物和探针一一进行BLAST验证(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，以保证引物的高特异性。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针，并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。
[0023]实施实例2：样本DNA提取
[0024]取0.2g海马的组织，振荡研磨仪中充分研磨成粉状后，使用DNA抽提试剂盒(Promega FF3750)，按照说明书进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在30μL
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100μL水中(可根据浓度需要进行调节)。提取过程设置以水替代样品的提取空白对照。
[0025]实施实例3：实时荧光PCR对样本的检测及对结果的判断
[0026]实时荧光PCR扩增反应。引物探针序列如表1所示，实时荧光PCR反应体系如下：10μL Premix Ex Taq(Takara)，上游引物(10pmol/μL)0.4μL，下游引物(10pmol/μL)0.4μL，探针(10pmol/μL)0.4μL，取上述提取的DNA液2μL，用水补足体积至20μL。应用实时荧光PCR仪lightcycle 480(Roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。
[0027]用于内参照引物探针的Real...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种实时荧光PCR实时荧光检测驼背海马、三斑海马和克氏海马的方法，包括以下步骤：(1)样本DNA提取；(2)实时荧光PCR扩增检测；(3)结果判定；其特征在于，实时荧光PCR扩增检测体系的引物和探针分别是：检测驼背海马的引物和探针是：IF
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F:CCACTGGCAGGGAATTTAGC(SEQ NO.1)IF
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R:TCACTAGGACTGCTCACACA(SEQ NO.2)FAM
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TGCTGGGGCTTCTGTAGATC
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Eclipse(SEQ NO.3)检测三斑海马的引物和探针是：IF
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F:GCTCCTGACATGGCTTTTCC(SEQ NO.4)IF
‑
R:ATGGGTCAAAGAATGTCGTGT(SEQ NO.5)FAM
‑
CCCTACCTGTACTAGCAGCC
‑
Eclipse(SEQ NO.6)检测克氏海马的引物和探针是：IF
‑
F:ATCGGAGCGCCTGATATAGC(SEQ NO.7)IF
‑
R:CGCCAAATTGCCTGCTAGTG(SEQ NO.8)FAM
‑
TTCTCCTCCTCCTTGCTTCG
‑
Eclipse(SEQ NO.9)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括内参照引物和探针是：18SrRNA
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F：CCTGAGAAACGGCTACCAT(SEQ NO.10)18SrRNA
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R：CGTGTCAGGATTGGGTAAT(SEQ NO.11)18SrRNA
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P：FAM
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TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT
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Eclipse(SEQ NO.12)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，实时荧光PCR扩增反应程...

【专利技术属性】
技术研发人员：虞惠贞，吴姗，张明哲，尹文秀，陈哲，张荃，沈旭芳，江惠君，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：